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现代生物化学实验技术 细胞与分子生物学实验室 杜 卫 第一章 概 述 一、生物化学实验技术发展简史 在20世纪，生物科学迅猛发展，其中生 物化学与分子生物学的进展尤为迅速。作为 一门最具活力和生气的实验科学，在21世纪 必将成为带头的学科，这主要有赖于生物化 学与分子生物学实验技术的不断发展和完善 。 20年代： 1、微量分析技术导致了维生素、激素和辅酶等 的发现。 2、瑞典著名的化学家T.Svedberg奠基了“超离心 技术”，1924年制成了第一台5000×g（5000 r/min8000 r/min）相对离心力的超离心机， 开创了生化物质离心分离的先河，并准确测 定了血红蛋白等复杂蛋白质的分子量，获得 了1926年的诺贝尔化学奖。 30年代： 电子显微镜技术打开了微观世界，使 我们能够看到细胞内的结构和生物大分 子的内部结构。 40年代： 1、英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（ 层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。 由此，层析技术成为分离生化物质的关键技术 。 2、 瑞典的著名科学家Tisellius建立了“电泳技术” ，从而开创了电泳技术的新时代，他因此获得 了1948年的诺贝尔化学奖。 50年代： 自1935年Schoenheimer和Rittenberg首次 将放射性同位素示踪用于碳水化合物及类脂 物质的中间代谢的研究以后，“放射性同位素 示踪技术”在50年代有了大的发展，为各种生 物化学代谢过程的阐明起了决定性的作用。 60年代： 1、各种仪器分析方法用于生物化学研究，取得 了很大的发展，如HPLC技术、红外、紫外、圆 二色等光谱技术、NMR核磁共振技术等。 2、1958年Stem，Moore和Spackman设计出氨基酸 自动分析仪，大大加快了蛋白质的分析工作。 3、1967年Edman和Begg制成了多肽氨基酸序列 分析仪。 4、1973年Moore和Stein设计出氨基酸序列自动测 定仪，又大大加快了对多肽一级结构的测定， 十多年间氨基酸的自动测定工作得到了很大的 发展和完善。 5、1962年，英国科学家Wilkins通过对DNA分 子的X-射线衍射研究证实了Watson和Crick的 DNA模型，与美国科学家Watson和英国科学 家Crick共同分享了当年的诺贝尔生理医学奖 ，他们的研究成果开创了生物科学的历史新 纪元。 在X-射线衍射技术方面，英国物理学家 Perutz对血红蛋白的结构进行X-射线结构分析 , Kendrew测定了肌红蛋白的结构，成为研究 生物大分子空间立体结构的先驱，他们同获 1962年诺贝尔化学奖。 在60年代，层析和电泳技术又有了重大的 进展，在19681972年Anfinsen创建了亲和层析 技术，开辟了层析技术的新领域。 1969年Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳技术测定了蛋白质的分子量，使电泳技术取 得了重大进展。 70年代： 1、基因工程技术取得了突破性的进展，Arber， Smith和Nathans三个小组发现并纯化了限制性内 切酶。 2、1972年，美国斯坦福大学的Berg等人首次用限 制性内切酶切割了DNA分子，并实现了DNA分子 的重组。 1973年，又由美国斯坦福大学的Cohen等人第 一次完成了DNA重组体的转化技术，这一年被定 为基因工程的诞生年，Cohen成为基因工程的创 始人，从此，生物化学进入了一个新的大发展时 期。与此同时，各种仪器分析手段进一步发展， 制成了DNA序列测定仪、DNA合成仪等。 80至90年代： 基因工程技术进入辉煌发展的时期。 1、1980年，英国剑桥大学的生物化学家Sanger 和美国哈佛大学的Gilbert分别设计出两种测 定DNA分子内核苷酸序列的方法，而与Berg 共获诺贝尔化学奖，从此，DNA序列分析法 成为生物化学与分子生物学最重要的研究手 段之一。他们3人在DNA重组和RNA结构研 究方面都作出了杰出的贡献。 2、1981年由Jorgenson和Lukacs首先提出的高效 毛细管电泳技术（HPCE），由于其高效、快 速、经济，尤其适用于生物大分子的分析， 因此受到生命科学、医学和化学等学科的科 学工作者的极大重视，发展极为迅速，是生 化实验技术和仪器分析领域的重大突破，意 义深远。现今，由于HPCE技术的异军突起， HPLC技术的发展重点己转到制备和下游技术 。 2、1984年德国科学家Kohler、美国科学家 Milstein和丹麦科学家Jerne由于发展了单克隆 抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术 而共享了诺贝尔生理医学奖。 3、1985年美国加利福尼亚州Cetus公司的Mullis 等发明了PCR技术（Polymerase Chain Reaction ）即聚合酶链式反应的DNA扩增技术，对于生 物化学和分子生物学的研究工作具有划时代的 意义，因而与第一个设计基因定点突变的Smith 共享1993年的诺贝尔化学奖。 4、美国哈佛大学的Folin教授和中国的吴宪教 授对生物化学常用的各种分析方法（血糖分 析、蛋白质含量分析、氨基酸测定等）的建 立作出了历史性的贡献。 5、1988年，美国遗传学家McClintock由于在二 十世纪五十年代提出并发现了可移动的遗传 因子而获得诺贝尔生理医学奖。 1989年，美国科学家Altman和Cech由于发现某 些RNA具有酶的功能（称为核酶）而共享诺贝 尔化学奖。 1993年，美国科学家Roberts和Sharp由于在断 裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。 1994年，美国科学家Gilman和Rodbell由于发现 了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝 尔生理医学奖。 1995年，美国科学家Lewis、德国科学家 Nusslein-Volhard和美国科学家Wieschaus由于在 20世纪4070年代先后独立鉴定了控制果蝇体 节发育基因而共享诺贝尔生理医学奖。 由近百年来生物化学及其实验技术的发 展史可以看出，该学科的发展与实验技术的 发展密切相关，每一种新的生化物质的发现 与研究都离不开实验技术，实验技术每一次 新的发明都大大推动了生物化学研究的进展 ，因而对于每一位现代生物科学工作者，尤 其是生物化学工作者，学习并掌握各种生物 化学实验技术就是极为重要的。 二、实验室规则 1、不得缺席、迟到、早退。 2、认真预习实验指导，明确实验目的，了解实验 原理、方法和步骤，充分做好准备工作。 3、进实验室应穿白大衣。 4、保持实验室的安静和整洁，不随地乱丢纸屑杂 物。 5、遵守操作规程，如实记录实验数据，不得抄袭 他人的实验记录或报告。 6、 不乱动与本实验无关的仪器设备，不乱用他组（人）的仪 器和材料。 7、实验室内各种仪器设备，未经同意不得擅自带出室外。不 熟悉仪器性能时，切勿随意动手。凡损坏仪器者，应立即 报告指导老师，查明原因，并视情节赔偿处理。 8、 在实验操作中要注意安全，听从老师的指导如发生事故要 立即采取安全措施，并及时报告指导老师。 9、 要节约水、电、药品试剂和材料。 10、 实验结束时，要认真整理好室内仪器设备，清点好各类 用具，做好清洁整理工作，关好门、窗、水、电，经指导 老师检查合格方可离开实验室。 11、 实验完毕，应按实验要求写好实验报告交给指导老师。 三、实验室常识 1、凡挥发性、有烟雾、有毒和有异味气体的实验，均应在 通风柜内进行，试剂用后严密风口。尽量缩短操作时间 ，减少外泄，操作者最好戴手套、口罩。 2、凡使用有机试剂需注意： （1）远离火源：如乙醚、丙酮、乙醇、苯等易燃试剂。 （2）最大限度减少与有机溶剂的接触。 3、见光易变质的试剂，用棕色瓶贮存或黑纸包装，并每次 少量配制。 4、容量瓶是量器，不能用作容器。 5、称量试剂应用硫酸纸，不可用滤纸。 6、标签纸大小应与容器相称，写明物质的名称、规格 、浓度、配制日期及配制人。 7、取用试剂后需将瓶塞塞严，放回原处。未用完的试 剂勿倒回瓶内。 8、配完试剂后，用过的器皿应及时用自来水浸泡以便 清洗和减少对器皿的侵蚀。 9、洗净器皿应倒置架上自然干燥或烤干。 10、贵重仪器要熟知使用方法，严格遵守操作规程，如 溅污应及时擦拭。 11、挪动干净玻璃仪器时，勿使手指接触仪器内部。 四、实验室安全 1、熟悉实验室环境，了解水、电阀门位置及开 关方法。 2、不要用湿的手、物接触电源。水、电一经使 用完毕，就立即关闭水龙头、电源及开关。 点燃的火柴用后立即熄灭，不得乱扔。 3、严禁在实验室内饮食、吸烟，或把食具带进 实验室。实验完毕，必须洗净双手。 4、绝对不允许随意混合各种化学药品，以免发 生意外事故。 5、一些有机溶剂使用时必须远离明火、热源， 用毕立即盖紧瓶塞。 6、倾注药剂或加热液体时，不要俯视容器。浓 酸、浓碱具有强腐蚀性，切勿使其溅在皮肤 或衣服上。稀释浓硫酸时，应将其慢慢倒入 水中，而不能相反进行，以避免迸溅。给试 管加热时，切记不要使试管口向着自己或别 人。 7、不要俯向容器去嗅放出的气味。能产生有刺 激性或有毒气体（如H2S、HF、Cl2、CO、NO2 、SO2、Br2等）的实验必须在通风橱内进行。 8、有毒药品（特别是氰化物）不得进入口内或 接触伤口。剩余的废液也不能随便倒入下水道 ，应倒入废液缸或教师制定的容器里。 9、金属汞易挥发，并通过呼吸道而进入人体内 ，逐渐积累会引起慢性中毒。做金属汞的实验 应特别小心，不得把金属汞洒落在桌上或地上 。一旦洒落，必须尽可能收集起来，并用硫磺 粉盖在洒落的地方，使金属汞转变成不挥发的 硫化汞。 10、实验室所有药品不得携出室外。 五、实验室急救 1、创伤：若是玻璃创伤，应先把碎玻璃从伤处挑 出。轻伤可涂以紫药水（或红汞、碘酒），必 要时撒些消炎粉或敷些消炎膏，用绷带包扎。 2、烫伤：伤处皮肤未破时，可涂擦饱和碳酸氢钠 溶液或用碳酸氢钠粉调成糊状敷于伤处，也可 抹獾油或烫伤膏；如果伤处皮肤已破，可涂些 紫药水或1%高锰酸钾溶液。 3、受酸腐蚀致伤：先用大量水冲洗，再用饱和碳 酸氢钠溶液（或稀氨水、肥皂水）洗，最后再 用水冲洗。如果酸液溅入眼内，用大量水冲洗 后，到医院诊治。 4、受碱腐蚀致伤：先用大量水冲洗，再用2%醋 酸溶液或饱和硼酸溶液洗，最后再用水冲洗 。如果碱溅入眼中，用硼酸溶液洗。 5、吸入刺激性或有毒气体：吸入氯气、氯化氢 气体时，可吸入少量酒精和乙醚的混合蒸气 使之解毒。吸入硫化氢或一氧化碳气体而感 不适时，应立即到室外呼吸新鲜空气。但应 注意氯气、溴中毒不可进行人工呼吸，一氧 化碳中毒不可施用兴奋剂。 8、毒物进入口内：将510ml稀硫酸铜溶液加入 一杯温水中，内服后，用手指伸入咽喉部，促 使呕吐，吐出毒物，然后立即送医院。 9、触电：首先切断电源，然后在必要时进行人 工呼吸。 10、起火： 六、玻璃仪器的清洗及各种溶液的配制 （一）洗涤方法： 洗涤程序：泡洗（泡）冲漱 1、新仪器的洗涤： 1）2%的盐酸浸泡数小时 2）自来水冲净 3）洗涤剂溶液中浸泡过夜 4）用试管刷擦洗容器内外壁 5）自来水冲10遍 6）蒸馏水漱洗内壁3遍 7）干燥备用 2、使用过的玻璃仪器的清洗 1）自来水洗刷至无污物。 2）用合适的毛刷沾去污剂（粉）洗刷，或 浸泡在0.5的清洗剂中超声清洗（比色皿决 不可超声） 3）用自来水彻底洗净去污剂。 4）用无离子水洗两次，烘干备用（计量仪 器不可烘干）。 （1）非定量敞口仪器的洗涤（试管、烧杯等） ： 1）洗涤剂溶液或清水中浸泡过夜。 2）试管刷蘸肥皂、洗衣粉擦洗容器内外壁 。 3）自来水冲10遍。 4）蒸馏水漱洗内壁3遍。 5）干燥备用。 注意：检查毛刷顶部是否裸露，洗刷时用力不可 过猛，以免戳破玻璃仪器。 （2）窄口仪器的洗涤（容量瓶、试剂瓶）： 1）洗涤剂溶液或清水中浸泡过夜。 2)洗涤剂溶液倒入容器内（约1/4）。 3)小心转动或摇动仪器。 4)自来水冲10遍。 5) 蒸馏水涮洗内壁3遍。 6)干燥备用。 3 石英和