高效液相色谱仪的应用

现代分析仪器应用技术, 高效液相色谱仪主讲：李春萍西北农林科技大学生命科学学院 lcccp2006126.com15991386045029-87092379,内容,色谱法基本知识高效液相色谱相关内容影响分离的因素实验前准备工作主要分析步骤,一、色谱分析法,起源基本概念分类,起源:1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特,色谱分离法 又称层析法，层离法等，是一种现代的物理化学分离、分析方法，广泛应用于化学、医药、生化、环保等领域，它既可用于混合物的分离和样品纯度的检查，又可用于对化合物的定性和定量分析。,分离植物色素,基本概念,基线：色谱柱中只有流动相通过时，检测器响应信号的记录值。它反映检测器本底的高低。噪声：由未知的偶然因素引起的基线起伏现象。峰宽：通过色谱峰两侧的拐点切线，在基线上所截的距离。保留时间：从进样点到色谱峰的顶峰的时间。死时间：流动相通过色谱系统的时间。在HPLC中为溶剂峰前沿出现的时间。死体积：进样器到检测器出口未被固定相所占有的空间。色谱峰：流出曲线上的突起部分。分配系数（K）：分配平衡后，组分在固定相与流动相中的浓度之比。K与组分、固定相、流动相及温度有关。容量因子（k）：也叫分配容量、容量比及质量分配系数等，是达到分配平衡后，组分在固定相的量与流动相中的量之比。,基本概念,基线漂移： 是基线的一种向上或向下的缓慢移动，可在较长时间（0.5-1.0h）内观测到。可掩蔽噪声和小峰，它与整个液相色谱系统有关。线性范围：当注入最小至最大进样量时，检测器响应处于与进样量成正比的范围。检测器的池体积：它应小于最早流出的死时间色谱峰的洗脱体积的1/10，否则会产生严重的柱外谱带扩展。灵敏度：也叫响应值，指一定量的物质通过检测器时所给出的信号大小。灵敏度越高，检测限越小。它是没有考虑噪声，其高低变化并不能严格表示检测器的检测能力。检测限：又称为敏感度，指在噪声背景上恰能产生可辨别的信号时（一般信噪比2）， 在单位体积或单位时间内需向检测器送入的样品量。它考虑了噪声，是全面衡量检测器性能的重要指标。检测限越小，仪器性能越好。,色谱法分类,按分离的机理可分为：吸附色谱：是利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差别而使混合物得以分离。分配色谱：是利用不同组分在固定相与流动相间的分配系数（或溶解度）不同而使混合物得以分离。 离子交换色谱：是利用不同组分对离子交换剂亲和力不同而使混合物得以分离。 凝胶色谱(排阻色谱)：是利用凝胶对不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同使混合物得以分离。 亲和色谱、毛细管电泳和毛细管电色谱。,色谱法分类,按操作形式可分为：薄层色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶薄层。纸色谱：分配色谱。柱色谱：吸附、分配、离子交换、凝胶柱色谱。按流动相状态的不同，可分为：气相色谱法 (GC)液相色谱法 (LC)超临界流体色谱 (SFC),二、高效液相色谱相关内容,特点研究对象高效液相色谱仪展示高效液相色谱仪工作流程高效液相色谱仪结构高效液相色谱法分类,1 HPLC特点,高效液相色谱法是20世纪60年代后期发展起来的一种新颖、快速的分离分析技术。高 压：压力可达（1.52-3.04) ×104 kPa。高 速：所需的分析时间一般少于1h。高 效：一根柱子可以分离100 种以上的组分。高灵敏度：用微升数量级的试样可进行分析。流动相选择范围广：大部分的有机溶剂以及水 和有机溶剂的混合物均可用。,经典色谱法,2 研究对象,高沸点化合物；难挥发及热不稳定的化合物；离子型化合物及高聚物等。,3 高效液相色谱仪展示,Waters LC-600,3 高效液相色谱仪展示,3 高效液相色谱仪展示,3 高效液相色谱仪展示,3 高效液相色谱仪展示,贮液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数。在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附-解吸的分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出。通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。,4 高效液相色谱仪工作流程,5 高效液相色谱仪的结构,高压输液系统进样系统分离系统检测系统色谱数据处理系统,高压输液系统,包括：流动相贮存器高压输液泵（核心部件）: 能提供150-450kg/cm2的压强；流速稳定，流量可以调节；应符合：密封性好、输出流量恒定、压力平稳、可调范围宽、便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。过滤器梯度洗脱装置 : 可将两种或两种以上的不同极性溶剂，按一定程序连续改变组成，以提高分离效果，缩短分离时间。,高压输液系统,泵的保养,使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡。,进样系统,注射器进样高压定量进样阀,5 高效液相色谱仪部件,进样方式与用量,六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，并且要求每次进样体积准确、相同；使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。,六通阀使用和维护注意事项：,样品溶液进样前必须用0.45µm滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。,分离系统,色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。金属管用得较多。一般备有一个前置柱（预柱）。柱子装填得好坏对柱效影响很大。发展趋势是: 减小填料粒度和柱径以提高柱效。,柱子形状,色谱柱一般长530cm，内径45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。,色谱柱的保养,对硅胶基键合相填料，水溶液流动相的pH值不得超出2-8.5范围(eg：C18柱pH范围是2-8)，温度不宜过高。 不能强烈震动，否则柱内填料床层产生裂缝和空隙。 阀件或管路一定要清洗干净；流动相要脱气；防止逆向流动，使固定相层位移，柱效下降。 进样样品要提纯并严格控制进样量； 在酸或碱性条件下使用后，应依次用水和甲醇清洗。 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品和适当的 溶剂来清洗色谱柱； 若长期不使用，应用适当有机溶剂保存并封闭。,检测系统,紫外检测器光电二极管阵列检测器示差折光检测器荧光检测器蒸发光散射检测器,紫外检测器（UVD）,特点：应用最广，对大部分的有机化合物有响应；灵敏度高；线性范围广；波长可选；对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱。,分析前，色谱柱平衡差不多时，打开检测器；分析完成后，马上关闭检测器。,光电二极管阵列检测器(PDA),由1024个二极管阵列组成，可检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图。,示差折光检测器（RID）,是通用型检测器（因为每种物质具有不同的折光指数）；灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。,类型 ：偏转式反射式干涉型,荧光检测器（FD）,高灵敏度、高选择性：对多环芳烃，维生素B、 黄曲霉素、卟啉类、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,蒸发光散射检测器（ELSD）,又称蒸发型质量检测器，属于通用型质量检测器。其工作原理：样品组分从色谱柱后流出，进入检测器后，经历雾化、流动相蒸发和（光源光路）检测三个步骤。,光源光路,Step 1: Nebulization Column effluent passes through nebulizer needle Mixes with nitrogen gas Forms dispersion of droplets,Step 2: Mobile Phase Evaporation Droplets pass through a heated zone Mobile phase evaporates from the sample particle Dried sample particles remain,Step 3: Detection Sample particles pass through an optical cell Sample particles interrupt laser beam and scatter light Photodiode detects the scattered light,ELSD优缺点,与示差折光检测器相比： 灵敏度高； 对流动相系统温度变化不敏感； 可进行梯度洗脱。与紫外-可见光检测器相比： 能解决最困难的HPLC检测问题。可对磷脂、皂苷、糖类、聚合物、树脂等无紫外吸收或紫外吸收系数很小的化合物进行检测； 无需测定定量校正因子。,蒸发光散射检测器（ELSD）,优 点：可以梯度洗脱；流动池死体积不影响检测灵敏度、喷雾气体消耗量少；雾化器和漂移管易于清洗。缺 点：受样品组分和流动相挥发性的影响。用 途：监测碳水化合物、脂肪酸、油脂、聚合物、药物等多种样品。,6 HPLC分类及分离原理,吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱亲和色谱,吸附色谱,固 定 相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5-10m的硅胶吸附剂。流 动 相：不同极性的一元或多元溶剂。原 理：根据填充剂吸附活性点对样品的吸收系数不同而分离。适用范围：分离相对分子质量中等的脂溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。,液固吸附色谱,分配色谱,固定相与流动相均为液体；基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）.,正向色谱法与反相色谱法比较,从下表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。,分配色谱,固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶表面的游离羟基上; C-18柱（反相柱）。,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相。 a. 硅氧碳键型： Si O C b. 硅氧硅碳键型：Si O Si C （稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广） c. 硅碳键型： Si C d. 硅氮键型： Si N,离子交换色谱,基本原理：组分在固定相上发生离子交换反应。 阳离子交换：R-SO3H+M+=R-SO3M+H+ 阴离子交换：R-NR4OH+X-=R-NR4X+OH- 应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,凝胶色谱,固定相： 凝胶(具有一定大小孔隙分布)；原 理：按分子大小分离，又称为排阻色谱（反筛子）。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。按试样中分子大小的不同来进行分离。充填剂多采用：一定孔径的多孔性聚合物。,