anxa10、mmp9和vegf在人hcc中表达的相关性、差异性及与临床病理特征关系的研究

南昌大学 硕士学位论文 ANXA-10、MMP-9和VEGF在人HCC中表达的相关性、差异性及与临 床病理特征关系的研究 姓名：肖恭卫 申请学位级别：硕士 专业：肿瘤学 指导教师：彭小东 20100601 摘要 j JJ l l ll l fI If i l lIf lIP II II Y 17 4 6 2 8 7 摘要 目的： 通过检测H C C 和癌旁正常组织中膜联蛋白A I O ( a n n e x i nA I O ， A N X A I O ) 、 基质金属蛋白酶- 9 ( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e 一9 ，删P 一9 ) 、血管内皮生长因 子( v a s c u l a re n d o t h e li a lg r o w t hf a c t o r ，V E G F ) 表达的差异性、相关性及 其与临床病理因素( 性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、分化程度、肝硬化、 临床T 分期) 的关系；初步揭示A N X A I O 在H C C 发生发展中的潜在作用，及这些 作用是否与已知的肝癌侵袭转移相关的细胞因子M M P 一9 、V E G F 有关。 方法： 收集2 0 0 8 年4 月至2 0 0 9 年8 月我院手术切除后经病理证实的H C C 术后标本8 0 例，肿瘤大小、直径、肝硬化均由病理确定，每例均有距癌至少l c m 远癌旁正常 肝组织。其中男6 7 例，女1 3 例，年龄2 7 一- - 7 6 岁，平均4 9 4 岁。患者术前均未行 化疗、放疗或介入治疗。每块蜡块切4 片，切片厚约4pm 。采用二步免疫组化法 检N H C C 组织标本A N X A I O 、V E G F 、M M P - 9 的表达差异，并根据检测结果，比较分 析表达差异与临床病理因素( 性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、分化程度、 肝硬化、临床T 分期) 的关系。使用S P S S1 3 0 统计软件对数据进行分析处理， 不同指标组之间分别进行卡方检验和相关性分析，P 0 0 5 为具有统计学意 义，检测水准取双侧。 结果： 1 A N X A I O 、M M P - 9 、V E G F 染色的形态学特点 ( 1 ) 以A N X A I O 抗体行H C C 及癌旁组织免疫组织化学染色，细胞胞浆内出现 明显的黄、棕褐色颗粒为A N X A l 0 表达阳部分细胞膜可见染色。 ( 2 ) 以M M P 一9 抗体行H C C 及癌旁组织免疫组织化学染色，H C C 细胞胞浆内出 现明显的黄、棕褐色颗粒为M M P - 9 表达阳性，部分细胞间质、胞膜可见染色。 ( 3 ) 以V E G F 抗体行H C C 及癌旁组织免疫组织化学染色，H C C 细胞胞浆内出 现明显的黄、棕褐色颗粒为V E G F 表达阳性，部分细胞间质、血管内皮细胞可见 染色。 2 A N X A I O 在H C C 组织及癌旁组织中的表达情况，与H C C 临床生物学行为的关系 A N X A I O 在H C C 中有5 2 例表达，阳性率为6 5 ( 5 2 8 0 ) ：在癌旁肝组织中有 T 摘要 7 3 例表达A N X A I O ，阳性率为9 1 3 ( 7 3 8 0 ) ，前者明显低于后者。与癌旁正 常组织中A N X A I O 表达强度相比，8 0 例H C C 中6 5 例( 8 1 3 ) 表达下调，1 2 例( 1 5 ) 无明显变化，3 例( 3 8 ) 表达上调。A N X A I O 表达与患者的性别、 年龄、肿瘤直径、肿瘤位置、肝硬化、临床T 分期无关( p 0 0 5 ) ，与分化 程度有关( p O 0 5 ) ：与性别、年龄、肝硬化、分化程度有关 ( 序0 0 5 ) 。 4 M M P 一9 在H C C 组织及癌旁组织中的表达情况，及与H C C 临床生物学行为的关 系 M M P - 9 在H C C 中有6 4 例表达，阳性率为8 0 ( 6 4 8 0 ) ；在癌旁肝组织中有7 2 例表达，阳性率为9 0 ( 7 2 8 0 ) ，后者明显高于前者。与癌旁正常组织中M M P 一9 表达强度相比，8 0 例H C C 中4 4 例( 5 5 ) 表达下调，1 5 例( 1 8 8 ) 无明显 变化，2 1 例( 2 6 3 ) 表达上调。M M P - 9 表达与患者的肝硬化、分化程度、 肿瘤位置无关( p 0 0 5 ) ；与性别、年龄、肿瘤直径、临床T 分期有关( p 0 0 5 ) ，b u tt h ed e g r e eo f d i f f e r e n t i a t i o np 0 0 5 ) ，b u tt h eg e n d e r 、a g e 、l i v e r c i r r h o s i sa n dd e g r e eo fd i f f e r e n t i a t i o np 0 0 5 ) ，b u tt h eg e n d e r 、 a g e 、t u m o rs i z ea n d c l i n i c a lTs t a g ep 3 c m ) 中A N X A l 0 表达下调比小肝癌( 3 c m ) 中A N X A l 0 表达下调比小肝癌( O 0 5 ) ；与性别、年龄、肝硬化、分化 程度有关( p 0 0 5 ) ，提示肝癌细胞分泌M M P 9 可能与上述 因素无关。M M P 9 在H C C 癌组织和癌旁组织中的表达阳性率高于正常肝组织 ( P O 0 0 1 ) ，并且M M P 9 的表达随癌的转移而升高( P 0 0 5 ) ：与性别、年龄、肿瘤直径、临床T 分期有关( p 3 c m ) 中A N X A l 0 表达下调比小肝 癌( 3 e m ) 多见，I I 、I I I 级肝癌比I 级多见，研究显示A N X A l 0 的下调和肝 癌细胞的恶性表型、血管侵袭以及肿瘤进展相关H o ·4 ¨。S h u H s i a n gL i u 等【3 5 J 检测 了1 8 2 例单病灶的原发性肝癌患者的肝癌组织，1 2 1 例有A N X A l 0 表达的下调， 这种下调与P 5 3 基因突变、早期肝癌复发以及4 年生存率低下有关，这种下调 的趋势与癌块的大小密切相关，在大肝癌中下调的幅度两倍于小肝癌中，仅从 临床病例分级就可以明显看出这一趋势，A N X A l 0 表达的下调和P 5 3 的突变往 往预示着肝癌的分级分期更高，预后更差。S h i a n Y a n gP e n g 等1 4 I J 检测了手术切 除的2 9 4 例单病灶原发性肝癌组织，发现A N X A l 0 表达的下调和甲胎蛋白、骨 联蛋白的上调都与肝癌的高分期分级、早期肝癌复发以及低下的l O 年生存率相 关，而且甲胎蛋白的上调和A N X A l 0 的下调相关。 5 2 膜联蛋白与肿瘤的转移的关系 D a i 等【4 2 】运用2 D E 及基质辅助激光解吸离子化时间飞行质谱对正常肝细胞和 肝癌细胞进行分析发现，3 4 种蛋白质差异表达。其中，A N X I 在高度转移H C C 中 明显上调表达，并用W e s t e r n 印迹和免疫组织化学验证，结果与质谱结果一致。 在膀胱癌f 4 3 】、普通型肾细胞癌脚1 及甲状腺癌【4 5 1 中，膜联蛋白A 1 表达水平在其 演进过程中下降明显。以上研究均说明，膜联蛋白A 1 表达水平的变化与肿瘤转 移密切相关。 5 3 膜联蛋白与肿瘤的诊断和治疗 很多研究表明，组织在恶变前后膜联蛋白A l 的表达水平明显变化。d e C o u p a d e 等【4 6 J 在肝癌动物模型中发现，肿瘤发生前膜联蛋白A 1 表达明显升高， 且早于甲胎蛋f 兰t ( A F P ) 的升高。F a l i n i 等【47 】用膜联蛋白A 1 的免疫细胞化学检测 诊断毛细胞白血病，其方法简单、经济高度敏感性，特异性达1 0 0 。以上研究 均说明，膜联蛋白A l 有可能成为肝癌、白血病的早期渗断的1 种标记物。膜联 3 2 综述 蛋白A 5 在结构上有其独特之处，即具有极高的与磷脂酰丝氨酸 ( p h o s p h a t i d y l s e r i n e ，P S ) 结合的能力；其N 末端没有蛋白激酶C ( p r o t e i nk i n a s eC ， P K C ) 的结合位点，因此不能成为P K C 的磷酸化位点，并具有抑制P K C 活性的 功能【4 引。膜联蛋白A 5 在皮肤鳞状细胞癌中表达增高，而且与细胞凋亡密切相关 【4 9 ，5 0 1 。P S 占细胞质膜总磷脂含量1 0 - - 一1 5 ，通常位于质膜脂质双层的内侧面， 一旦细胞凋亡发生，P S 就快速地再分布于细胞膜表面。凋亡开始后膜联蛋白A 5 与细胞的结合位点可增加1 0 0 10 0 0 倍左右，因而膜联蛋白A 5 是细胞凋亡早 期非常敏感的指标【5 l 】。目前通过荧光标记的膜联蛋白A 5 已经成为体外检测凋 亡的重要方法。国外更开始应用放射性核素标记膜联蛋白A 5 进行整体动物凋亡 核素显像的实验研究1 5 2 ，5 3 1 。 化疗药是治疗恶性肿瘤的常用手段之一，但化疗药的使用也常产生耐药。 W a n g 等【5 4 J 运用N o r t h e r n 印迹分析药物敏感细胞( M C F 7 ，M D A 一M B 2 3 l ，H 6 9 ， S K O V - 3 和H L 6 0 ) 和I 耐药细胞( M C F 7 A R ，M D A M I T O ，H 6 9 A R ，S K O V V L B 和H L 6 0 A R ) 的膜联蛋白A 1m R N A 表达情况发现，耐药细胞中的膜联 蛋白A 1 表达明显高于药物敏感细胞。再转染膜联蛋白A I 的c D N A 至M C F 一7 ， 然后对该细胞进行无药培养，结果发现转染细胞对阿霉素，阿美兰及鬼臼乙叉 甙的耐药性增长了2 5 倍。将逆转的膜联蛋白A 1c D N A 转染给S K O V - 3 细胞 会降低膜联蛋白A l 的表达，同时不会影响膜联蛋白家族的其他成员，结果显示 细胞对这些药物的敏感性增长了3 - - 8 倍。说明肿瘤细胞对化疗药的抵抗与膜联 蛋白A l 的表达密切相关，膜联蛋白A l 可能是一个潜在抗癌靶点。 综上所述，膜联蛋白是一类功能广泛的蛋白质家族，涉及囊泡运输、胞吐 作用中的膜融合、信号传导和钙离子通道的形成、调控炎症反应、细胞分化和 细胞骨架蛋白间的相互作用等多种功能，其中对膜联蛋白A 1 、A 2 、A 5 和A 1 0 的相关研究较为深入且发现它们与肿瘤关系密切，相关领域的研究正逐步开展， 有待进一步加强对膜联蛋白的认识。 参考文献 【1 】D o n n e l l yS R ，M o s sS E A n n e x i n si nt h es e c r e t o r yp a t h w a y C e l lM o l L i f eS c i ， 19 9 7 ，5 3 ：5 3 3 ·8 【2 】G e i s o wM J ，F r i t s c h eU ，H e x h a mJ M ，e ta 1 Ac o n s e n s u sa m i n o a c i ds e q u e n c er e p e a ti n T o r p e d o a n dm a m m a l i a n C a 2 + - d e p e n d e n tm e m b r a n e ·b i n d i n gp r