annexin vpi双染法和mtt法评价无镍奥氏体不锈钢对人牙龈成纤维细胞的影响

A n n e x i n V P I 双染法和M T T 法评价无镍奥氏体不锈钢 对人牙龈成纤维细胞的影响 T h ee v a l u a t i o no nt h ei n f l u e n c eo fn i c k e l f r e ea u s t e n i t i c s t a i n l e s ss t e e lt oh u m a n g i n g i v a lf i b r o b l a s tb yu s i n g A n n e x i n V P Id o u b l e - s t a i n i n gm e t h o da n dM T Ta s s a y 导 一级学科：里膣匡堂 二级学科：里膣堕鏖匡鲎 论文课题起止时间：2Q ! ! 生§旦= 2Q ! 至生圣旦 论文完成时间：2Q ! 至生圣旦 中国医科大学( 辽宁) 20 12 年3 月 一 中国医科大学研究生学位论文独创性声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或 其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢惠 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：斗 日期：丝! ! ：S ! 塑 中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规息即：研究生在攻读 学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后， 发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯 作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关 部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以 公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其 他手段保存论文。 论文作者签名： 指导教师签名： 日 期： y ，·y ·川 一 彻， 一 砌J 铴D 歹 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要3 二、英文缩略语6 三、论文主体 前言············一·”····7刖 百”“”“”“”“”“”， 实验材料与方法9 实验结果 1 4 讨论···”·······························“·1 7 结论 ····”·····················1 9 本研究创新性的自我评价2 0 四、参考文献2 1 五、附录 文献综述2 3 致 射····“··················3 1 个人简介3 2 ·中文论著摘要· A n n e x i nV P I 双染法和M T T 法评价无镍奥氏体不锈 钢对人牙龈成纤维细胞的影响 目的 金属材料具有韧性和高强度的特点，在口腔材料中得到广泛应用。在临床上 由于磨损、腐蚀等原因导致金属离子析出而产生细胞毒性。每一种口腔材料在应 用于临床前都要进行大量实验以确保其在临床应用中具有良好的理化性能及生物 相容性。B I O S S N 4 无镍不锈钢是中科院金属研究所研发的一种奥氏体医用不锈钢 材料，可应用于磁性附着体的激光焊接不锈钢封套，使稀土类永磁体防腐性能明 显提高。这种不锈钢完全抛弃了镍元素，采用氮元素强化奥氏体基体，这种材料 优良的机械性能已经通过实验得到验证。本实验通过M ，丌法和A n n e x i n V F I T C P I 双染法检测B I O S S N 4 含氮无镍奥氏体不锈钢和其他4 种金属对人牙龈成 纤维细胞凋亡的影响，进而评价B I O S S N 4 无镍奥氏体不锈钢的生物相容性。 材料与方法 l 、细胞培养 人牙龈成纤维细胞用含1 0 胎牛血清的D M E M 高糖细胞培养基在3 7 “ ( 3 、5 的C 0 2 培养箱中培养并传代。 2 、M T T 实验 以5 种金属浸提液及阴性对照培养2 4 h 、4 8 h 、7 2 h 后，用自动酶标仪检测吸 光度值，计算细胞增殖率P 。 3 、A n n e x i t r - - f i t c P I 双染色法检测细胞在凋亡不同阶段的凋亡数 量。 将5 种金属合金及阴性对照组的浸提液与人牙龈成纤维细胞联合培养4 8 h 后， 分别进行F I T C 、P I 双染色，然后通过流式细胞仪检测不同实验组细胞的早期凋亡 率。 结果 ， 1 、在M T T 比色实验中，阳性对照组与其他各组之间的吸光度值的差异均有 统计学意义( P 无镍奥氏体不锈钢 钴铬合金 3 1 7 L 奥氏体不锈钢 纯铜。 2 、实验组细胞经A n n e x i nV - f i t c 和P I 双染色后，流式细胞仪检测结果表明各 实验组引起的细胞早起凋亡率是不同的。其中金合金组最低并且最接近阴性对照 组，无镍奥氏体不锈钢组与金合金组较接近，其他金属组均高于金合金组，其中 纯铜组引起的细胞早期凋亡率最高，且远高于其他各组，其细胞早期凋亡率由低 到高的顺序为：金合金 0 0 5 ) ，与其他各组有统计学意义( P O 0 5 ) ，与其他各组有统计学意义( P O 0 5 ) 。 钴铬合金组，3 1 7 L 组，纯铜组与任意组比较均有统计学意义( P O 0 5 ) 。 讨论 医用金属材料通常具有良好的机械性能和生物相容性，但人体环境是一个复 杂的生理介质，医用金属材料在人体的使用过程中会不可避免的发生腐蚀和磨耗 现象。合金与口腔局部组织密切接触，在合金与组织之间形成微环境，金属离子 释放到这些区域后，由于缺乏唾液的稀释，浓度逐渐升高，当达到一定浓度后， 就能改变该区域细胞代谢，严重时可使该区域细胞代谢瘫痪。F a c c i o n iF 【2 2 】等人 研究了固定矫治器中金属离子释放对口腔黏膜细胞D N A 损害，并发现戴固定矫治 器的患者口腔黏膜中镍和钴的含量分别是正常人的3 4 倍和2 8 倍，细胞活性明显 降低并且与金属离子的含量呈负相关。口腔金属材料在口腔内导致不良生物学反 应几乎都是由于金属离子的释放而引起的，影响金属离子的析出的主要因素包括： 合金组分，温度，时间，p h 值，机械应力等。在口腔环境等其他外界因素不可改 变的情况下，减少金属材料组分中的有害离子析出就成了改良口腔金属材料生物 相容性的基本手段。迄今国内外改良医用奥氏体不锈钢生物相容性主要采取2 种 方法：一是发展新型不锈钢，从而使得钢的磨损腐蚀性能发生本质的改变1 2 3 1 。二 是进行离子注入、等离子体热化学扩散处理等表面改性。但是离子注入、渗氮等 改性工艺在提高耐磨损性能的同时，多以牺牲材料的耐腐蚀性能为代价，导致表 面改性作用失效。因此，目前尚缺乏适宜的生物医用奥氏体不锈钢耐磨损腐蚀表 面改性技术。而改变奥氏体不锈钢的成分，研发新的奥氏体不锈钢则成为主要的 提高奥氏体不锈钢生物相容性的方法。 由图l 可见，M 1 v r 实验中各实验组的细胞相对增殖率基本呈先升后降走势， 这主要与细胞生长周期有关。4 8 h 时细胞为对数生长期，所以三个时间点中4 8 h 的细胞相对增殖率最高，但不影响评价各实验组间的相对差异。金合金表现最优， 其次是无镍奥氏体不锈钢，钴铬合金，3 1 7 L 不锈钢，纯铜。这与流式细胞仪的检 1 7 测结果吻合。产生这样的结果主要有两方面原因：一方面由于几种实验金属的合 金成分不同。齿科金属材料可能导致的不良生物学反应几乎都是由于合金金属中 金属离子的析出所引起的。在铁、铬、镍、钼、钴等人体必需的微量元素中，镍、 钴、铬离子对人体都有致敏反应【2 4 , 2 s 1 。S h e t t l e m o r e 等1 2 6 】研究发现：N i C r 合金腐 蚀释出的金属离子N i 、B e 可改变牙龈成纤维细胞的形态、生存能力及增殖能力。 金、铂的细胞毒性甚微；纯银是细胞毒性强的元素。铜的毒性大于金、铂、钛、 银和镍等金属，是引起细胞生长抑制的主要因素。另一方面各组金属材料生物相 容性的差异还与其自身抗腐蚀性有关。S j o g r e n 等【2 7 】通过合金成分、预处理、操作 等对牙科铸造合金腐蚀的影响进行分析，认为合金成分的改变明显影响了合金抗 腐蚀的性能及其细胞毒性。在四种金属材料中，金合金耐腐蚀性强，有优异的生 物相容性。钴铬合金的主要成分是钴和铬，由于钴和铬都是致敏的金属，从而钴 铬合金的早期凋亡率大于无镍奥氏体不锈钢。3 1 7 L 不锈钢析出液对人牙龈成纤维 细胞的生长抑制作用最大，这与其组成成分中含有较大比例的镍、铬、铝元素有 关。B I O S S N 4 不锈钢不含有镍元素，其中的氮又提高了钢的耐腐蚀性，使得其金 属离子析出减少且析出离子中也不含镍离子。虽然实验结果显示了B I O S S N 4 不锈 钢对细胞有轻微的毒性，然而极轻度的毒性是大多数医用材料都可能存在的，并 且其相对增殖率和早期凋亡率均优于钴铬合金和3 1 7 L 不锈钢，表明它不会对人体 组织产生明显的影响。因而在牙科铸造合金的研制和临床选用时，要从这两方面的 多种因素加以考虑，尤其在临床应用中，要对所选用的铸造合金的成分、性能、 结构及可能产生的不良生物学反应具有充分的了解。 与以往使用L 9 2 9 细胞研究无镍奥氏体生物相容性的实验相对比【2 8 - 3 0 ，各实验 组生物相容性由好到差的顺序相同，金属材料作用于人牙龈成纤维细胞表现的生 物相容性都优于作用于L 9 2 9 细胞，其中无镍奥氏体表现出的差异最小，其次是金 合金、钴铬合金、3 1 7 L 不锈钢。这种差异可能是由于人体正常细胞比其他细胞系 更耐受牙科合金材料的毒性【3 ¨。W a t a h a 等【3 2 】曾用4 种不同的细胞株比较1 4 种铸 造合金析出的金属离子毒性，发现不同的细胞株对大多数金属元素有不同的反应。 虽然使用L 9 2 9 细胞和人牙龈成纤维细胞得出的实验结论相同，但实际数值上还是 有一定差异，且金属不同差异大小也不同，所以其他实验、检测中使用这两种细 1 8 胞能否得出相同结论还有待论证。牙用材料可释放一些可溶性的毒性成份，如N a + 、 C a 2 + 、A 1 3 + 和氟化物等，这些可溶物质主要影响邻近的牙组织、口腔粘膜的上皮细 胞、成纤维细胞及各种免疫细胞，并对这些细胞的生长、附着增殖及代谢等功能 产生影响1 3 3 】。选择人牙龈成纤维细胞作为实验对象能够较准确真实地反映口腔材 料的生物相容性。 结论 1 、各实验组生物相容性由好到差的顺序依次为：金合金、无镍奥氏体不锈钢、 钴铬合金、3 1 7 L 奥氏体不锈钢、纯铜。 2 、无镍奥氏体不锈钢有较好的生物相容性，可考虑应用于临床。 1 9 ·本研究创新性的自我评价· B I O S S N 4 不锈钢为中科院金属研究所新近研发的一种医用无镍不锈钢，本试 验应用M 1 v r 比色法和流式细胞仪分析B I O S S N 4 不锈钢对人牙龈成纤维细胞的影 响，对其生物相容性作出初步了评价，从而为其临床应用提供了参考。 ·参考文献· l 俞耀庭，张兴栋·生