adp27mt对肝癌细胞及裸鼠移植瘤生成抑制和凋亡的影响
华中科技大学 硕士学位论文 Ad-p27mt对肝癌细胞及裸鼠移植瘤生成抑制和凋亡的影响 姓名：于洋 申请学位级别：硕士 专业：腹腔镜外科 指导教师：王国斌;陈先祥 20090401 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Ad-p27mt 对肝癌细胞及裸鼠移植瘤生长抑制和对肝癌细胞及裸鼠移植瘤生长抑制和 凋亡的研究凋亡的研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院 硕士研究生： 于 洋 导 师： 王国斌 陈先祥 中中 文文 摘摘 要要 背背 景景 目前认为，肿瘤的发生主要有两方面的原因，一是肿瘤细胞的凋亡障 碍，二是细胞异常增殖，也就是细胞周期调控机制紊乱、细胞周期调控蛋 白失调，导致细胞生长失控。细胞周期受到信号转导途径和反馈环路的严 密调控，这个过程是否正常与细胞的生长、分化、衰老及癌变密切相关， 因此肿瘤不仅仅是增殖、分化异常的疾病, 更是凋亡异常的疾病, 调控细 胞增殖和凋亡目前逐渐成为肿瘤治疗研究的一个新热点。 p27 是新近发现的一种抑癌基因，P27 蛋白作为一种调控细胞周期的 枢纽蛋白，可以以多种方式调节肿瘤细胞的增殖或凋亡。其抗癌机制已成 为生物医学领域的重要研究课题。 对 p27 基因进行修饰， 使其编码的第 187 位氨基酸 （苏氨酸） 突变为蛋氨酸或丙氨酸而成的突变型 p27 基因 （p27mt） 编码产生的蛋白能抗降解、更稳定，具有比野生型 p27 基因（p27wt）更 强的抑制肿瘤细胞生长及诱导凋亡活性。 目目 的的 应用Ad-p27mt转染人肝癌细胞SMMC-7721及其裸鼠移植瘤， 探讨外源 性突变型p27对人源性肝癌细胞SMMC-7721和裸鼠移植瘤生长抑制和凋亡 的影响。 方方 法法 方法一：将腺病毒介导的突变型 p27 cDNA( Ad-p27mt)转染人肝癌细 胞 SMMC-7721，Western blotting 检测 p27、Bcl-2、Bax 的表达；流式细胞 2 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 仪(FCM)、 H 3-TdR 掺入法等观察 Ad-p27mt 对肝癌细胞生长抑制作用， DNA 片段分析及 TUNEL 检测细胞凋亡。 方法二：Ad-p27mt注射入肝癌裸鼠移植瘤中，绘制肿瘤生长曲线，计 算肿瘤生长抑制率，免疫荧光法检测p27的表达。 结结 果果 Adp27mt转染肝癌细胞后，p27表达增强，Bax/Bcl-2比例增高,细胞 增殖明显受抑制， G0G1 期细胞比例增加， 明显产生凋亡.采用Adp27mt 基因治疗肝癌裸鼠移植瘤生长受抑制，肿瘤生长抑制率达57.09% 。 结结 论论 Ad-p27mt 基因转染对肝癌具有较显著的体内、 外抑制作用和诱导凋亡 作用，其机制是通过增强 p27 表达，使细胞产生周期阻滞,诱导凋亡的机理 可能是 Bax/Bcl-2 比例增高所引起。 【关键词关键词】 p27；腺病毒； 肝癌； 基因治疗； 细胞周期；凋亡 3 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Inhibitory efect and Apoptosis of p27mt gene transfer mediated by adenovirus on hepatic carcinoma cells and its transplanted models in nude mice Department of laparoscopic Surgery, Union Hospital, Tongji Medical college of Huazhong University of science and technology Master candidate：Yu Yang Supervisor：Prof. Wang Guobin 、Chen Xianxiang Abstract Background Until now , it to be considered that the occurrence of Cancer are there for two reasons,one is Barriers to tumor cell apoptosis ,and the other is Abnormal proliferation of cells , means dysregulation of the cell cycle control mechanism and cell cycle regulatory protein disorders , Lead to cell growth out-of-control .The Cell cycle was tight regulated and controled By signal transduction pathways and feedback loops ,this process Normal or not , Closely related to Cell growth, differentiation, aging and oncogenesis, for this reason , tumor was not only a disease with unusual proliferation and differentiation, but also a disease with abnormal apoptosis,Regulation of cell proliferation and apoptosis gradually become the hot areas of therapy for cancer research. p27,the new finding tumor suppressor gene,the P27 protein as a key protein of cyclin dependent kinases inhibitors (CDKIs), it can regulation of cell cycle and apoptosis in more than one way.and its anticancer mechanisms to become the key areas of biomedical research. To genetically modified the p27 gene 4 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 with mutation of Thr-187/Pro-188 (ACGCCC) to Met-187/Ile-188(ATGATC)， this mutant- type p27 gene coding protein has role of Anti-degradation , and more stable , Stronger inhibition of tumor cell growth and induced apoptosis activity more than the wild -type p27gene. Objective We used recombinant adenovirus vector expressing a mutant type p27 gene (Ad-p27mt), and transduced into hepatic carcinoma cells SMMC-7721 and its transplanted models in nude mice, To investigate inhibitory effect and apoptosis to hepatic carcinoma in vivo and in vitro and its maybe mechanisms Methods Methods 1:Adenoviral vectors were used to transfect mutated p27 cDNA into human SMMC-7721 cell line The expression of P27、 Bcl-2、 Bax was detected by Western blot , cell growth inhibition was observed by Flow cytometry, 3H-TdR incorporation and so on;DNA fragment analysis, terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling to determination of apoptosis. Methods 2:The therapeutic effects with intratumoral injection of Adp27mt into transplanted tumor on nude mice were evaluated with growth curves and inhibitiory rates of tumor Expression of p27mt were detected by immunofluorescence technique Results The expression of P27 、Bax、Bcl-2 expressions protein was increased significantly in SMMC-7721 cell line transfected with Ad-p27mtand caused the cell growth suppression,cell G0/G1 cycle arrest and apoptosisThe growth of tumors in gene therapy with p27mt were obviously suppressed，the growth inhibition rate reached 57.09% 5 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 Conclusion p27mt gene transfer mediated by adenovirus vector has significant inhibitory effect and induced apoptosis activity on hepatic carcinoma in vivo and vitro The mechanisms include upregulation of p27mt expression，cause the carcinoma cell cycle arrest. The induced cell apoptosis maybe via regulating bax/bcl-2 expressions. 【 Key words】p27； Adenovirus； Hepatocellular carcinoma； Gene transfection ； Cell cycle；apoptosis 6 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 英文缩写及中英文对照 英文缩写及中英文对照 英文缩写英文缩写 英文全称英文全称 中文全称中文全称 AP Alkaline Phosphatase 碱性磷酸酶 CDK cyclin -dependent kinase 细胞周期蛋白依赖性 激酶 C
