海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性及噬菌弧菌da5对细菌的生物控制

中山大学 博士学位论文 海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性及噬菌弧菌DA5对细菌的生物 控制 姓名：温崇庆 申请学位级别：博士 专业：海洋生物学 指导教师：周世宁 20090529 中山大学2 0 0 9 届博士学位论文 海水养殖环境蛭弧菌类生物多样性 及噬菌弧茵D A 5 对细菌的生物控制 专业：海洋生物学 博士生：温崇庆 指导教师：周世宁教授 温崇庆 摘要 蛭弧菌类生物( B d e l l o v i b r i o a n d 1 i k eo r g a n i s m s ，B A L O s ) ，是一类以裂解其 它革兰氏阴性菌为生的小型寄生性细菌，普遍存在于自然和人工生境中，对环境 细菌的群体结构和动力学可能具有重要影响，在有害细菌的生物控制上具有潜在 应用价值。 本论文首先通过分离培养结合分子分型和系统鉴定，对广东省湛江市海水养 殖较集中的东海岛和南三岛虾池及其近岸海水B A L O s 进行了较系统调查。结果 显示以溶藻弧菌( V i b r i oa l g i n o l y t i c u s ) z o u A ( z o u A ) 为宿主菌，双层平板计数虾池及 其近岸表层海水B A L O s 含量为4 7 1 2 3 8p f u m L ，且B A L O s 含量与异养细菌含量 呈正相关。本研究首次将P C R 一变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e l e l e c t r o p h o r e s i s ，D G G E ) 用于二元培养状态下B A L O s 的直接分型，并通过靶向1 6 S r D N AV 3 区P C R D G G E 和噬菌弧菌科( B a e t e r i o v o r a e a c e a e ) 特异的16 Sr D N A 扩增 核糖体D N A 限制性分析( a m p l i f i e dr D N Ar e s t n c t i o na n a l y s i s ，a R D r 认) 将1 3 0 株 B A L O s 分离物分别区分为五种和四种种系型( p h y l o t y p e ) 。系统分析表明本研究所 有B A L O s 分离物均属于噬菌弧菌科噬菌弧菌属( B a c t e r i o v o r a x ) ，但包含在四个不 同的类群( c l u s t e r ) ( I V 、V I 、I X 、X ) ，且两种分型方法给出的结果在类群水平上 完全一致。类群菌株在所有水样中都有分离到，并且是1 3 0 株分离物中的最 优势类型( 4 0 8 ) ；类群X 菌株除在虾池N F 样品中未检测到外，也普遍存在于 各水样中；类群菌株则从所有盐度相对较低( B A ；而丰富度 指数即C h a o l 值估算的O T U 丰富度情况则是文库A C B D ，其中D 文库的 C h a o l 值与实际观测到的O T U 数( 2 1 ) 很接近，B 、D 文库的C h a 0 1 值也都与其实 际O T U 数较接近，而A 文库被估算的O T U 丰度值( 5 1 ) 贝J J 是实际观测值( 1 5 ) 的三 倍以上，但其标准偏差也较大。上述结果从1 6 Sr R N A 基因序列相似性 9 8 5 划分的O T U 角度表明本研究中的各虾池海水都具有高度多样的B a c t e r i o v o r a x 类 型，且不同水样间可能存在一定程度的差异。 表3 - 2 噬菌弧菌和吞菌弧菌1 6 Sr R N A 基因克隆文库分析 T a b l e3 - 2A n a l y s i so f B a c t e r i o v o r a xa n dP e r e d i b a c t e r1 6 Sr R N Ag e n ec l o n el i b r a r i e s ·B a c 、P c r _ 手g l B a c + P c r f f f 别指B a c t e r i o v o r a x 文库、P e r e d i b a c t e r T 史库和两类B A L O s 总文库，A 、B 、C 、D 为水样编号； ¨“士”号后的数值表示C h a o l 的标准偏差 5 9 中山大学2 0 0 9 届博士学位论文 温崇庆 5 。 E 口口古二当二当一当当当当 0B 1 0AI川A37B 6B oc M 埘 o T u b 7 P e lo fW E b e r s z m p k A 口口由吉占昌苫占当占三苫苫兰昌苫占占 O T U 帅o ft t e r $ 4 m p l e B 冈门门n 门臼臼由自由白自由由白白白古占占占占占占占古占古 2 ， 2 r §1 。 。5 。口曲由白白由白由古白古古白占占白占占苫苫昌 图3 - 6 虾池水样噬苗弧苗1 6 Sr K N A 基田立库O T U 类型分布 柱状圈t 的数字和星号( ) 分别表示某种0 1 u 的克降数量和仅桠某个女库中m 现的轴特型 F i 9 3 ·6P r o f i l i n go f O T U t y p e so f B a e t e r i o v o r o 口c 1 6 8r R N Ag e n e l i b r a r i e s f r o ms h r i m pp o n d w a t 盯s a m p l e s 6 0 。n¨U。门¨¨U。 3 2 2 l l _tj目目。目一u 。n¨U“。几U 一一几¨¨¨¨U M ；。!ju -jjj：jo 中山大学2 0 0 9 届博士学位论文温崇庆 3 2 3 2 噬菌弧菌类群多样性分析 从类群( 序列相似性9 7 ) 的角度分析B a c t e r i o v o r a x 克隆文库的多样性情况 基本上与上述从O T U ( 序列相似性i 9 8 5 ) 角度分析的结果相似( 表3 - 2 ) ，只是各 文库的类群数及其n l 、F 和C h a o l 值都随着序列相似性标准的降低而相应减小。 5 2 种O T U 类型的克隆序列代表了3 3 个B a c t e r i o v o r a x 系统群或潜在“种，( 表3 3 ， 图3 7 ) ，其中只有四个( i x 、X 、X I 、X I I ) 属于已知的可培养B a c t e r i o v o r a x 类群 ( D a v i d o v & J u r k e v i t c h2 0 0 4 ；P i n e i r oe ta L2 0 0 7 ) 。这表明本研究虾池海水中 B a c t e r i o v o r a x 在类群水平上也存在高度多样性，且绝大多数都属于目前还未分离 培养过的类群。另一方面，属于上述四个已知类群的克隆在整个文库中却占有一 半的数量，特别是其中的群和群x I 克隆分别为最优势和次优势类群。因此若 仅从数量上看，虾池海水中相当一部分B a c t e r i o v o r a x 可能是相对容易培养的。 若以克隆数5 的类群作某一文库中的优势类群，除C 文库优势类群数为 九个外，A 、B 、D 三个文库中的优势类群数均为四个( 表3 3 ) 。类群的克隆 数以约3 6 的总比例为四个B a c t e r i o v o r a x 总文库中的绝对优势类型，其中除在C 文库中的比例( 约9 8 9 ) 仅次于最优势的类群X I I ( 1 2 0 9 ) 外，占其余三个文库克 隆数的比例均超过第二优势类群克隆数的一倍以上，而类群X I I 克隆在其它三个 文库中均未检测到。类群X I 以约1 0 的数量为总文库中的第二优势类群，且数 量上分别占A 、D 、B 文库中的第二、第四和第五位，但在C 文库中仅出现过一 次。B 1 0 和A 1 3 克隆群分别为总文库中的第三和第四优势类群，两者还分别是B 和D 文库中的第二优势类群。 3 2 4 基于噬菌弧菌1 6 Sr D N A 文库的系统发育分析 5 2 种B a c t e r i o v o r a xO T U 的代表克隆编号、G e n B a n k 序列收录号及B L A S T 分析获得的最相似序列信息见附录1 。结果表明所有比对到的最相似序列均来自 咸水( 主要是海水) 环境的细菌分离物或克隆，绝大多数( 4 0 个) O T U 类型的克隆序 列与数据库中已知序列相似性小于9 7 ；仅有1 2 个O T U 类型( A 1 ，A 6 ，A 8 ，A 9 ， A 3 7 ，A 8 2 ，B 2 8 ，C 3 ，C 8 1 ，C 8 2 ，D 1 ，D 8 8 ) 的序列匹配度大于或等于9 7 的相似性， 其中1 0 个( A 1 ，A 6 ，A 8 ，A 9 ，A 3 7 ，A 8 2 ，B 2 8 ，C 3 ，C 8 1 ，D I ) 具有对应的可培养 B a c t e r i o v o r a x 序列，另两个即C 8 2 和D 8 8 对应的最相似序列分别为相似性9 7 来自北极海水沉积物的克隆序Y l J ( E U 0 5 0 8 3 9 ) 和相似性9 8 来自大堡礁海水沉积 6 1 中山人学2 0 0 9 届博十学位论文温崇庆 物的克隆J 列( D Q 2 5 6 7 0 4 ) ，但与它们最相似的可培养菌株1 6 Sr D N A 序列柑似眭 均小到9 6 。 袁3 - 3 虾池水样噬菌弧菌1 6 sr R N A 基冈文库类群分析 T a b l e3 - 3 C l u s t e ra n a l y s i so f 口c k “1 6 Sr R N A g c n e l i b r a r i e s f r o ms h r i m p p o n d w a I e rs a m p l e s 系统 # 垒坐登壅堕! 坐堂皇生! 坐壁苎堡旦坐堂苎堕垫兰堕 教n n 【匕兜降数n 丹兜降n 分克* n 分克降盐n “ M I x4 95 32 G4 14 45 7 9 98 9 3 t3 4 8 3 l3 03 57 l XO0】10 9l】1 0333 75l3 7 X I 2 32 50 0 443 5 Il10889 93 69 8 9 R 优势盗群p 5 ) 兜降数韭J n 丹加H * 表m 妻!喇m!曼德!耋耋M兰|!墨三!耋暑!m i 5趣i瑚。5 9 j 4；2 6 2。”7。2”i，。m 。詈瑚m。三|。猫。埘。埘。泌姗三!m m 0 0 n 0 2 3 0 0 0 000 0 2 0 O 4 0 0 3 0 0 2 3 m ，蛐 。；。螂删哪瑚渖顿。m i O 3 0 O 6 0 O 0 O O 4 6 8 4 2 5 2 2 2 5 7 ，O m O O O 蚍。娜。薹¨帅加。 O 0 8 0 2 2 n，2 2 ，2 O O O O O 0 O 6 0 O 0 O 0 0 0 蛇 。蛹。嘤蹶l i。i。 ；i；。i；。；0 0 m枷蝴引邯叫阱脚l耋脚|耋删“哪伽吲肼嘶册蚴叫脚脚嗍撇 中山大学2 0 0 9 届博士学位论文 温崇庆 图3 - 7 噬菌弧菌系统进化树 分支旁的数字为b o o 娜超过5 0 的置信值；标尺表示l 的核苷酸序列差异；本研究和G 锄B a l ，1 【中 的未培养克隆序列分别以实心圆和空心圆表示·