重组dna技术与基因工程(4)
重组DNA技术与基因工程,5,2,3,4,1,6,重组DNA技术与基因工程的基本概念,重组DNA技术所需的基本条件,重组DNA技术的操作过程,目的基因的克隆与基因文库的构建,外源基因在大肠杆菌中的表达,外源基因在酵母中的表达,4 目的基因的克隆与基因文库的构建,基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调控机制及生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。,A 鸟枪法,4 目的基因的克隆与基因文库的构建,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,鸟枪法操作的改进,鸟枪法克隆目的基因的局限性,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适,用于原核细菌目的基因的克隆分离。,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,染色体DNA的切断,超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端。,全酶切： 片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目,的基因断开，大小不可控。,部分酶切： 片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。,与载体连接,如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；,如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。,鸟枪法克隆目的基因的基本战略,如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；,转化受体细胞,如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。,筛选含有目的基因的目的重组子,菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。,鸟枪法操作的改进,使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从,使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA,而提高重组子中目的重组子的出现频率。,鸟枪法操作的改进,例如：已知某目的基因位于1.8 kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进,在连接前将DNA片段进行分级分离,2.0 kb,1.6 kb,1.8 kb,行拼接。,鸟枪法操作的改进,冻融法 滤纸法 吸附法 低融点凝胶法 溶解法,凝胶DNA片段回收技术,鸟枪法克隆目的基因的局限性,工作量较大，需要了解目的基因的背景知识,不能获得的最小长度的目的基因,不能除去真核生物目的基因的内含子结构,B cDNA法,4 目的基因的克隆与基因文库的构建,cDNA法克隆目的基因的基本战略,cDNA法分离目的基因的基本程序,cDNA法法克隆目的基因的局限性,cDNA法克隆目的基因的基本战略,mRNA,cDNA第一链的合成,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,cDNA第一链,引物,退火,逆转录酶,dNTPs,cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第二链的合成,煮沸,NaOH,自身引导法：获得的双链cDNA 5 端会有几对碱基缺失。,AAAAAAAAAAAAAA,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTT,OH 3,Klenow,dNTPs,S1,DNApol dNTPs,RNaesH,置换合成法：获得的双链cDNA 5 端也会有几对碱基缺失。,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,TTTTTTTTTTTTTTp 5,5,S1,AAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTTp 5,5,AAAAAAAAAAAAAAOH 3,TTTTTTTTTTTTTT 5,5,AAAAAAAAAAAAAA 3,3,T4-DNA ligase,cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第二链的合成,dCTP,TdT,引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5 端序列。,AAAAAOH 3,TTTTTp 5,3 HO,AAAAAOH 3,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,3 HOCCCCCCC,TTTTTp 5,5 pGGGGGGG,AAAAAOH 3,NaOH,退火,Klenow,dNTPs,cDNA法克隆目的基因的基本战略 cDNA第二链的合成,cDNA法克隆目的基因的基本战略,双链cDNA的克隆,双链平头的cDNA通常可以使用下列三种方法克隆入载体中：,平头末端直接与载体连接，但插入的片段无法回收。,平头两端分别接同聚物尾，最好是AT同聚物尾，这样重组,分子可通过加热局部变性和S1核酸酶处理回收插入片段。,加装人工接头引入酶切口，以便插入片段回收，如RT-PCR。,cDNA法分离目的基因的基本程序,完备分离程序,提取细胞总mRNA，合成总cDNA，将之全部克隆，然后借助于合适的筛选手段找到目的重组子。 筛选时，若使用的是多拷贝载体，则采用菌落原位杂交法筛选；若使用的是表达型载体，则采用菌落免疫杂交法筛选。 完备分离程序适用于mRNA分子数少的目的基因的克隆，如人胰岛素基因、干扰素基因、凝血因子VIII基因等。,cDNA法分离目的基因的基本程序,特异分离程序,提取细胞总mRNA，琼脂糖凝胶电泳分离，回收目标mRNA，由此合成双链cDNA，然后进行克隆。 特异分离程序较适用于mRNA丰度极高的目的基因克隆如血红蛋白基因等。,cDNA法分离目的基因的基本程序,差异分离程序,利用两组细胞mRNA种类的差异，分离克隆差异mRNA所对应的cDNA，因而这种程序较适用于分离克隆新基因。 例如：正常的大鼠FR3T3成纤维细胞中，有些新基因是不能自发表达的，需在多瘤病毒感染之后方可转录。任务是要分离克隆这些新基因，进而研究其生物学功能。,差异分离程序,多瘤病毒感染的FR3T3细胞,正常的FR3T3细胞,总mRNA,总mRNA,cDNA,双链cDNA,单链cDNA,提取mRNA,合成cDNA,合成第二链,克隆,提取mRNA,共价交联,上柱,原位杂交,病毒诱导表达的基因 cDNA克隆,cDNA法克隆目的基因的局限性,并非所有的mRNA分子都具有polyA结构,细菌或原核生物的mRNA半衰期很短,mRNA在细胞中含量少，对酶和碱极为敏感，分离纯化困难,仅限于克隆蛋白质编码基因,C PCR法,4 目的基因的克隆与基因文库的构建,PCR法定向扩增目的基因的基本原理,PCR克隆目的基因的基本程序,盒式PCR扩增法,PCR技术的诞生与发展,反向PCR扩增法,PCR技术的诞生与发展,聚合酶链反应（ Polymerase Chain Reaction，PCR ）又称为PCR,扩增技术，是一种高效、快速、特异性的体外DNA聚合程序。,1985年，美国PE-cetus公司人类遗传研究室的,Kary mullis发明了具有划时代意义的PCR技术；,1988年，美国PE-cetus公司推出世界上第一台,PCR热循环仪，从而使PCR反应自动化；,1993年，Kary mullis因发明PCR技术获得诺贝,尔化学奖；,1995年，定量PCR仪诞生，使定量研究DNA靶序列成为现实。,使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是：已知待扩增目,的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应,所需的双引物。,PCR法定向扩增目的基因的基本原理,目的基因,5,变性,加热,引物,退火,底物,聚合,5,5,加热,变性,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,退火 引物,底物,聚合,加热,变性,引物,退火,底物,聚合,由Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为Taq DNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的,PCR克隆目的基因的基本程序 基于T载体的切接克隆法：,5,5,A,A,T,T,5,5,PCR扩增产物,T 载体,T7,lacZ,MCS,ori,Apr,T载体克隆。,PCR克隆目的基因的基本程序,基于同源重组的In-Fusion克隆法：,5,5,5,5,5,5,与载体5端15个碱基相同的序列,目的基因序列,PCR扩增,In-Fusion酶介导同源重组,盒式PCR扩增法,染色体DNA,Sau3A部分酶切,加装盒式接头片段,5 端不含磷酸基团,变性 引物退火,扩增,P1,P2,P1,P2,退火,延伸,测序设计保守引物,基因组DNA切割并自连成环,反向PCR扩增法,TAGTSLVVRK,NYWSSAEPHC,蛋白质,5,5,5,5,5,5,5,5,根据已知的氨基酸序列设计简并引物,简并引物介导RT-PCR,保守引物介导PCR,测序确定目标基因的两端序列,D 化学合成法,4 目的基因的克隆与基因文库的构建,化学合成法的基本战略,化学合成的单元操作,DNA化学合成的用途,化学合成法的基本战略 全基因合成,化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略：,小片段粘接法：,混合退火,根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长
