胞内游离Ca的测定方法
5页1、Pluronic F-127 (F127)美国 Molecular Probes Inc.产品。Ultima 型共聚焦激光扫描显微镜为美国 MERIDIAN Instruments Inc 产品。1. 光源:Ultima 型 50Mw UV,200Mw Visible2. 激发波长:351-364nm,488nm,514nm3. 扫描系统:Ultima 为台阶扫描,精度 0.1um目的:监测细胞胞浆中游离钙的动态变化原理:正常细胞内游离钙浓度Ca2i 为 0.1 umol/L,胞外钙离子浓度为 1.2-1.3mmol/L,相差达 10000 倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用;病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱,直至细胞坏死或凋亡;钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见,测定Ca2i 在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。Fluo-3/AM 等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯(AM 酯)的形式导入细胞,在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸,与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓
2、度的变化而变化。100ug Fluo-3/AM 溶于 100ul DMSO 中,就是 1ug/ul,1mg/ml,1g/L方法:1.预先用二甲基亚砜 (DMSO)将 Fluo-3/AM 配制为 1mmol/L(1g/L)原液,-20oC 避光保存。F127 用 DMSO 配制成 20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将 Fluo-3/AM 稀释成终浓度为 10umol/L,并加入 0.1的 Pluronic F-127 备用。2.移去培养皿中的原培养液,用 PBS 液冲洗心肌细胞 2 遍,加入 10umol/L染料液 1ml,置于 37oC 的 CO2 孵箱里避光温育 30min。3.将染色后的心肌细胞用 PBS 液冲洗 3 遍,加入 1mlDMEM 液后置于 20 倍光学显微镜观察区域及层面,用 LSCM 观察 Fluo-3 染色的细胞的某一层面的荧光图像。4.启动 LSCM,选择 488nm 氩离子激光,启动计算机,运行 lasersharp2000 软件,选择 time-course 程序,设置扫描间隔时间(30sec) 、扫描次数(300 次) ,开始扫描。5.将数据输入
3、excel 进行整理、统计、分析。一、细胞内游离 Ca2+浓度(Ca 2+i)的测定按经典方法,以钙离子敏感的荧光探针 Fura-2/AM 或 Fluo-3/AM 来检测细胞内Ca 2+i。Fura-2 的结构类似于四羧酸的 Ca2+螯合剂 EGTA,能以 1:1 的比例特异性地与 Ca2+结合,与 EGTA 不同的是 Fura-2 可发出荧光,并且结合 Ca2+后荧光特性有改变,Fura-2 及其与 Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm 和 340 nm,这种变化可指示 Ca2+的存在及其浓度。 Fura-2 为一极性很大的酸性化合物,不能进入细胞内,但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为 Fura-2/AM。后者脂溶性很强,又消除了负电荷,容易通过细胞膜,随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为 Fura-2,与胞浆中的游离 Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且,Fura-2与 Ca2+解离容易,随着游离 Ca2+的增加或减少,其荧光强度便随之变化。因此,Fura-2 的荧光强度与 Ca2+i 呈比例关系,据此可
4、以测定Ca 2+i 及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。 Fluo-3/AM 是继 Fura-2/AM 等之后研制的新一代 Ca2+ 荧光指示剂,与Fura-2/AM 类似,Fluo-3/AM 进入细胞后,酯基被水解掉,Fluo-3 与细胞内游离Ca2+ 结合,因而其荧光强度可以反映细胞内游离 Ca2+ 的浓度。但优于 Fura-2/AM 的是,Fluo-3 与 Ca2+ 结合时的荧光强度较未结合 Ca2+ 的游离形式高 40 100 倍,避免了自发荧光的干扰,因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映Ca 2+i 的变化。此外,Fluo-3 与 Ca2+ 亲和力低,易解离,适合测定细胞内 Ca2+ 的快速、微量变化。Fluo-3 在可见光光谱激发,激发波长为 488 nm,可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。Ca 2+荧光探针用于检测Ca 2+i 的基本原理如图 7.1 所示。图 Ca2+荧光探针检测Ca 2+i 的基本原理a, 代表一个细胞模型;b,Ca 2+荧光探针的负载;c,Ca 2+荧光探针去酯
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