2DE流程及磷酸化染色
6页1、12DE 流程流程一向电泳一向电泳(1):):蛋白样品的准备蛋白样品的准备(从上午(从上午 11 点到下午点到下午 6 点;或者是第一天晚上到第二天上午)点;或者是第一天晚上到第二天上午)1.蛋白的裂解:蛋白样品从-20 C 取出,加入 300l 蛋白裂解液,进行蛋白裂解方法 1:4 C 冰箱过夜 方法 2:4 C,800rpm,4h 以上4 C ,13000 rpm,15min,上清转移至 1.5mL 离心管。 2.蛋白的定量:(如果样品数目少时,标准曲线和样品一块做)(1)取 5l 样品于 2mL 离心管中,加入 500l precipitant,迅速涡旋,室温静置 2-3min(2)加入 500l co-precipitant,迅速涡旋,室温静置 2-3min(可不静置)(3)4 C ,13000 rpm,5min,倒掉上清;(此期间配工作液)再离心一次,用移液器吸尽上清。(4)每管中加入 400l Milli-Q 和 100l copper solution,涡旋(5)每管中加入 1mL 的 working color reagent(工作液),迅速涡旋工作液配方: color
2、 reagent A: color reagent B=100:1 (1100l: 11l)(6)室温静置 15-20min 左右,480nm 测定吸光度值,加完工作液后 40min 内要测定完成。(以 Milli-Q 做空白对照)蛋白标准曲线的测定蛋白标准曲线的测定:按照下表取 BSA 样品于 2mL 离心管中,如上面的方法进行蛋白的定量,以吸光度为横坐标,蛋白含量为纵坐标作图,用 EXCEL 表计算蛋白标准曲线公式.123456BSA (l)0510152025蛋白量(g)01020304050吸光度0.830.7290.6570.5910.510.408BSA 蛋白含量:2g/l22D蛋白标准曲线(20110302)y = -122.93x + 101.32 R2 = 0.995010203040506000.10.20.30.40.50.60.70.80.9 吸光度蛋白含量(g)将样品的吸光度值带入公式,求出 y 值。 y/5 即为每 l 样品中蛋白的含量。3. 一向电泳中蛋白样品的加量:传统双向电泳的蛋白上样量为 600g(,18cm 胶条)和 1200g(pH4-7,18c
3、m 胶条) 。以 pH3-10 的胶条为例,加样量为600/ y/5一向电泳(一向电泳(2):):IEF-PAGE(头天下午头天下午 5-6 点上好一向,第二天晚上点上好一向,第二天晚上 7-8 点下一向,这样可以保证晚上二向电泳的点下一向,这样可以保证晚上二向电泳的顺利进行顺利进行)预约一向电泳仪,提前准备好 holder,提前 0.5h 从冰箱取出水化液2.准备上样液:样品1样品2蛋白裂解样品l水化液l358蛋白裂解样品1358蛋白裂解样品21%溴酚蓝(可不加)1lDTT1mgIPGbuffer1.83l胶条号切角3混匀样品,将样品4,13000 rpm,15min。(离心期间取出IPG胶条,室温放置10min)3.上样:(1)加样(从正极往负极加,注意无气泡),将样品均匀加入到holder内。(2)小心撕下保护膜,胶面朝下放入holder中,胶条正极要抵头,从正极到负极,轻轻放下胶条,避免生成气泡。(3)吸取适量覆盖油(1.5 ml)轻轻加在IPG胶条表面,以防止IEF-PAGE过程中液体的蒸发,盖上盖子。4.电泳:(1)打开电源,小心将holder放在IEF水平电泳仪上,正极对
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