溶组织内阿米巴培养
12页1、1第十八章 寄生虫的人工培养及动物模型第一节 寄生虫的人工培养一、溶组织内阿米巴培养可分有菌培养(xenic culture)和无菌培养(axenic culture)(一)有菌培养主要用 Robinsons 培养基,不仅可以培养溶组织内阿米巴,也可以培养哈门氏内阿米巴、结肠内阿米巴、微小内蜒阿米巴等多种阿米巴。一般应用 6ml7ml 或更小的螺旋有盖培养管。1组成成分:(1)盐水琼脂斜面:溶解 15g 琼脂粉和 7g8g 氯化钠于1000ml 蒸馏水中,分装在小试管中高压灭菌(121,15min),当琼脂冷却至 75左右倾放使其形成斜面。(2)红霉素:将 0.5g 实验室用红霉素粉剂置于无菌容器中,加入 20ml 70%乙醇溶解,4放置 2h 以上,而后加灭菌水至 50ml。(3)米粉:梗米粉经高压消毒或 180干燥灭菌。(4)配制 50mmol 邻苯二甲酸氢钾,pH6.3,高压灭菌。(5)血清:56 30min 灭活,甚至未灭活的牛或马血清均可使用。(6)R 溶液贮存液:NaCl 50g (NH4) 2SO4 10g 柠檬酸.2H2O 220g MgSO4.7H2O 0.5g KH
2、 2PO4 5g乳酸(90%纯度) 4ml,加水至 950ml,调节 pH 至 7.0,最终调节容量至 1000ml,分装高压灭菌,制备成贮存工作液。使用时将100ml 贮存液加入 850ml 双蒸水,调节 pH7.0 分装高压灭菌。(7)BR 溶液:25ml R 工作液与 1 个克隆的大肠杆菌,37振摇培养 48 小时。(8)BRS 溶液:在上述 BR 溶液中加入等量血清,继续培养2448 小时即可。2操作步骤在含琼脂斜面的培养试管中加入 10mg 米粉、120l 红霉素液和足够遮盖斜面量的邻苯二甲酸氢钾和 BRS 液 4:1 混合液,加入少量(约 50mg)粪便,混匀,37培养 24 小时后,移去培养上清液,加适量入 4:1 混合液并加入 60l 红霉素和米粉。37继续培养 48 小时后,取米粉与粪渣混合物一滴,以碘液染色或直接观察有无滋养体;若未发现虫体再加入米粉,再培养 24 小时观察。若虫体阳性可将少量培养混合液转入新鲜培养基中继续培养,即为转种。(二)无菌培养最常用是 BIS-33 培养基,为液体培养基。培养在 6ml 的玻璃有盖培养管中,由于阿米巴为兼性厌氧代谢,故应紧盖
3、管盖,并呈5的角度放置。虫体对培养基和血清的要求甚高,甚至水质也会影响其生长,并非一般实验室可行。目前我国生产的培养基试剂尚不3能成功培养虫体。BIS-33 培养基含三个组分,即营养液、维生素混合液、成牛血清。(1)营养液:K2HPO4 1.0g KH 2PO4 0.6g NaCl 2g L半胱氨酸HCl 1g 维生素 C 0.2g 枸橼酸铁胺 22.8mg 葡萄糖 10g 消化蛋白胨,酵母提取物 30g溶于 600ml 双蒸水中,调节 pH 至 6.8,最终容量调至 870ml,分装,高压消毒后,冷却至-20贮存。(2)维生素培养液有多种,如下一种是最易配制的。溶液 A:烟酰胺 45mg; 盐酸维生素 B6 4mg; 泛酸钙 23mg; 盐酸硫胺 5mg; 维生素 B12 1.2mg,均溶于双蒸水,定容至25ml;溶液 B:核黄素 7mg(加 0.1N NaOH 数微升使其易溶解)加双蒸水至 45ml;溶液 C:叶酸 5.5mg(加 0.1N NaOH 数微升使其易溶解) 加双蒸水至 45ml;溶液 D:d-生物素 2mg,加双蒸水至 45ml;溶液 E:DL-6,8-硫辛酸 1mg
4、,溶于 5ml 95%乙醇中,加入 500mg Tween 80 并定容至 200ml,0.2m 滤膜过滤灭菌,4暗处保存。4(3)成牛血清成牛血清需经 4 小时左右灭活方可用于培养,但需避免反复冻融。(4)完全培养剂营养液 87ml,成牛血清 10ml 或 15ml,维生素混合液 2ml,混合,冷藏,随时可用。应用 6ml 的螺旋有盖培养管,360.5培养,7296 小时转种一次。可将向有菌培养的滋养体与 37的 BIS-33 培养基混匀,使米粉等粗颗粒自然沉淀,取含滋养体的上清液通过滤纸,400g 2min 离心,弃上清液。将含滋养体的沉淀溶入含青霉素、链霉素、卡那霉素、多粘菌素的 BIS-33 培养液中,并加入数滴福尔马林固定的短膜虫,在 6ml 螺旋有盖培养管中培养。24 小时后可见滋养体贴附试管壁,换一次培养液,继续培养 48 小时或 72 小时后转种,使其逐渐转为无菌培养,并可进一步克隆化。二、阴道毛滴虫培养可分有菌培养和无菌培养。1有菌培养主要是肝胨糖培养基。一般应用 12ml 或 6ml 的螺旋有盖培养管,可从病人阴道后穹隆取材直接放入培养管中,加入青霉素1000u/m
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