免疫组化定量分析-永诺生物-1

1、用Image-ProPlus ( IPP ) 分析免疫组化图片1.免疫组化图片分析原理?根据染色染料颜色的深浅(光密度)及分布面积 大小来确定目标蛋白的量。?染色区域分布面积与目标蛋白量成正比。?染色的颜色深浅(光密度)与目标蛋白量的定量 关系符合朗伯-比尔定律，是对数关系。1.1光密度与灰度迷惑人的不同概念?光密度：吸收光的物质的光学密度。（optical density,就是常说的OD值）光密度值是直接与 染色物质的量相关的。?灰度：灰是不够黑，是反射亮度的单位。电子 照片上像素的亮度称为灰度。Gray: between white and blackExample: 1.The bright value on display screen is gray value. 2.The dark value on a white paper is also the gray value.Optical Density: 吸收光线的物质的光学密度光学密度.?被测物质的量越多，光密度(OD值)越高，透射出的光越少，反 映在照片上就越黑。?OD值与物质的量直接相关，灰度值与OD值成对数关系，

2、符合 朗伯-比尔定律。?理论上OD值是从零到无穷大。实际应用中，OD值的范围常用 0 - 2.0或者0 - 3.0。用OD值是正确的?分光光度计与酶标仪的测定值是OD值?透射的显微镜图象上的光强度要用OD值?蛋白电泳条带的测量也是OD值。?萤光显微镜及萤光分光光度计的测量值是萤光强度 (Fluorescence intensity)?用EB染色的DNA凝胶电泳条带也是萤光强度，但处 理方法与光密度相同，故也用OD值。这个OD与前面 的OD又有不同的意义。它就是荧光的光密度。反映 着荧光物质的多少。?Western Blot条带的测定也要使用OD值来进行定量.处理照片时用的却是灰度?各种图象被拍摄成照片进行数字图象处理时， 是对照片的灰度进行测量和计算的。但最后得 到的结果还是需要换算回OD值来表达。?所以对免疫组化照片的分析结果应该是一个 OD值，光密度。不应该是灰度。?准确地说，是对免疫组化照片的特定染色区域 的灰度进行分析从而测量出组织切片的光密度 值。用标准样品才能把OD值 与样品量关联到一起?OD值是一个没有单位的相对值。?使用酶标仪或分光光度计时要作标准曲线。对电 泳条带进行

3、定量分析时一样要作标准曲线。?电泳条带照片的灰度值与样品量的关系为指数函 数。在把灰度值转换成OD值时，用一个标准点进 行定量分析是不准确的。多个标准点的标准曲线 亦有很大误差，因此只能说是半定量分析半定量分析。?在实际应用时,可以直接测量OD值,用以表达染色 物质的相对的量.1.2定量分析的指标： IOD ( Integrated option density )与density?将图片上各点的光密度值累加起来，得到IOD。 此值与目标物质的总量成正比。?IOD值除以目标分布区域的面积，得到平均 density，此值反映了目标物质的单位面积浓度。 对样品照片进行数字图像分析比较时，就是比 较它们之间的平均光密度值的大小。1.3比较两张照片的染色物质量的差别?两张照片染色深度一样，染色面积大的质量大照片A照片B比较两张照片的染色物质量的差别?两张照片染色区域面积相同，染色深的质量大照片A照片B这回该怎么看？?A的颜色深，面积小。?B的颜色浅，面积大。照片A照片B比较体积！面积光密度areaIODmeandensitydsyxdensityIODS /)(),(=1.4 实际图片的情况很

4、复杂的。?阳性样品染色深，阴性样品染色浅。直接比较整张图片的IOD 等于在比较整张图片的mean density哪一个染色物更多？?染色区域颜色接近，染色面积有差异。使用不同的area会得到不同的结论 要结合病理情况来判断。?IOD对整张图片的面积作平均。?IOD对特定组织区域面积作平均。?IOD对显色的组织区域作平均。对整张图片区域进行平均的情况比较少右上角的空白应该扣除。也许应是这个特定的组织区域这个区域是染色的区域。往往在计算 IOD时同时计算出来，但以此为平均 面积往往并不正确。对单个细胞的分析比较?单个细胞的IOD?单个细胞的mean density边界不清晰的贴壁细胞?整张图片IOD/细胞个数（照片中细胞数目不多， 数起来不费事）细胞簇的分析?测量整张图片黄色区域IOD。?再测量细胞分布的区域面积 area。?对染成蓝色的细胞核计数，作为细胞数N。?以 IOD /（N * area）作为统计指标。2.从图片上分析光密度方法 的技术发展?简单测量整张照片的光密度值。?在照片上随机选取数个区域，测量其光密度值。 计算其平均值作为整张照片的光密度值。?在照片上准确选择被染上染料的

5、特定颜色的区 域，计算这些区域的累积光密度值（IOD）， 进而计算统计区域的平均光密度值。2.1测定整张照片的光密度-图象分析仪?其测定原理有点象分光光度计，直接测定切片 的整体光密度。?可以根据照片上象素点的亮度来区分测定区域?其缺陷是显而易见的。复染上的其他颜色的染 料也会产生光密度吸收，导致严重的干扰。2.2 抽样测量光密度?在彩色电子图片上选取目标颜色区域，抽样测 量这些小区域的灰度值，取其平均值作为比较 染色深浅的指标。随机选取几个区域 但是能作到“随机”吗？2.3 ImagePro plus(IPP)的独特优势。?准确地按照一个颜色标准来选取一个AOI (area of interesting ) 。测量这个区域的光密 度参数。使用IPP比前两种方法更好。?在查到文献中使用的图象分析方法是前两种的 时候，完全可以用IPP的分析测量来代替。结 果更加准确。不必照搬文献上所述的方法。随 着计算机技术的发展，以后也许还会有更好的 图象分析方法及图象分析程序的。3.用IPP分析免疫组化图片过程?选取图片上具有染料色调的区域（AOI，area of interesting）。?测量该

6、区域的IOD。?选择并测量有效统计区域的面积?计算选择区域内的光密度平均值IOD/area （density mean）?计算同一实验组切片各照片的平均及标准差。?用统计学方法分析各实验组的平均density mean之间是否有显著性差异。3.1用于免疫组化半定量分析的照片拍 摄?与普通显微镜照片不同，用于免疫组化分析的 显微镜照片有其特殊的拍摄要求。显微镜光源?正确调整显微镜光源为日光色温的白色光。此时是加蓝色 滤光片，灯丝电压为10V左右。一般的显微镜上都会有指 示的。此时的镜下视野会感觉明亮得有点刺眼。?不能通过调整光圈的方法减低亮度，这会影响到图象的清 晰度。光圈与聚光镜要按照柯勒方法调整以保证照片的清 晰.?不能加过大的灰度镜减低亮度。用25%的灰度滤光片还行。 6%的灰度滤光片会导致色彩失真。?如果照明光源不白，有偏色，将直接影响到照片色彩，从 而使得测量结果不准确。固定显微镜的工作条件?不仅是光源亮度，除了更换样品时调节载物台 位置，其他部件一律固定下来。特别是不要来 回切换使用不同放大倍数的物镜。使用一个物 镜拍摄所有的照片后，再切换到另一个物镜上 拍摄照片。?为保证显

7、微镜光源的稳定一致，所有照片应该 一次拍摄完成。不能分数次拍摄。若能给显微 镜加上稳压电源就更好了。这能保证显微镜光 源亮度的稳定。应该使用手动控制曝光的相机?对每张照片要使用相同的相同的曝光时间，而不是由 相机自动控制曝光。?染色深的阳性样品就应该拍摄得较暗。染色浅 的阴性对照样品则应该拍摄得较明亮。控制相机曝光时间?要把相机曝光时间控制到使视野中空白的地方 呈现纯亮的白色。?拍摄出的照片上，没有组织的空白处的背景灰 度值应达到230左右。可以使用图象分析软件 测量一下空白处的背景灰度值。低于230的背 景灰度值很容易产生色彩的偏离，会影响到图 像分析数值的偏差。?把空白灰度值调到230相当于在分光光度计上 调节100%透射。背景的影响?左图：暗且偏蓝的背景严重降低了黄色的IOD 值。而且影响到了阳性区域的色调。较暗的背景值对分析测量的影响0.20.11.01.21.100.40.81.21.6阳性样品阴性样品背景背景+阳性样品背景+阴性样品显著性 差异无显著 性差异扣背景后依然没有显著性差异阳性样品1.20.1 阴性样品1.10.1 背景10.1 阳性样品-背景0.20.1 阳性样品-背景0.10.11.11.20.10.21.000.40.81.21.6阳性样品阴性样品背景阳性样品-背景阳性样品-背景注意误差线，依然 没有显著性差异避免使用相机的自动白平衡?自动白平衡功能是相机根据照片总体色彩情况自动对每张照片进 行各自不同的白平衡校正。这会严重影响分析测量的准确性。显 微镜照片用一两种染料染色，照片的色彩就应该是不平衡的，不 能校正。由于免疫组化照片上黄色染色多,自动白平衡会将图片色 调向蓝色调整,导致色彩的失真.最好使用专业CCD拍摄?民用数码相机适用于拍摄日常生活中的照片， 其自动曝光、自动白平衡功能会有效改善照片 的直观效果。但对于显微镜照片，这些功能却 会改变照片的原始面貌，严重影响照片的分析 测量结果。要想关闭这些功能，往往要进行很 复杂的设置。?不使用自动白平衡校正，但可以使用手动的白 平衡校正背景色彩校正背景色彩。对所有照片进行统一的背 景色彩校正。使得照片中空白的背景呈白色。

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