肝细胞生长因子及其受体c-met在原发性肝癌中的表达

1、分类号U D C硕士学位论文密级肝细胞生长因子及其受体c m e t 在原发性肝癌中的表达T h ee x p r e s so fH e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ra n di t s一一一一r e c e p t o rc - M e ti np r i m a r y _ h e D a t o c e l l u l a rC a r c l n o m a作者姓名：学科专业：学院( 系、所) ：指导教师：论文答辩日期兰垡! ：至：生：蔡翊普外科湘雅二医院王群伟教授答辩委员会主席中南大学二。一二年五月VV U 原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：知日期：兰f ! 年月丛曰学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位

2、论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：鱼叠导师签名F t 期：业年月旦F t硕士学位论文中文摘要肝细胞生长因子及其受体c m e t 在原发性肝癌中的表达摘要目的：研究肝细胞生长因子( h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ，H G F ) 及其受体C m e t 在原发性肝癌( p r i m a r yl i v e rc a r c i n o m a ，P L C ) 中的表达。方法：3 1 歹O P L C 患者作为实验组，肝硬化失代偿患者、轻度慢性乙肝患者、肝功能正常的胆囊息肉患者各3 1 N 组成3 个对照组，采用酶联免疫方法( E L I S A ) 定量测定实验组术前1 天、术后第4 、9 、11 天血清的H G F 浓度，采用免疫组织化学分析及逆转录聚合酶链反应( R T - P C R )

3、检测癌组织、癌旁组织及正常肝组织中C m e t 蛋白表达，同法分组检测各对照组血清H G F 浓度；同时分析术前血清H G F 水平及癌组织中c m e t 表达程度与不同临床病理因素之间的关系及影响手术后血清H G F 水平变化的因素。结果：P L C 患者及肝硬化失代偿患者血清H G F 浓度高于肝功能正常的胆囊息肉组及慢性乙肝组，差异有统计学意义，P L C 患者与肝硬化失代偿患者之间血清H G F 浓度比较差异无统计学意义；术后H G F浓度上升峰值出现在术后第4 天，术后第9 、11 天逐渐下降；从术前到术后第4 天，大区段切除L g d , 区段切除者的血清H G F 浓度上升更明显伊= O 0 2 1 ) ；癌组织中C m e t 蛋白表达强度明显高于癌旁组织及正常组织，但在癌旁组织中，合并肝硬化组C m e t 蛋白表达高于无肝硬化组( P = O 0 2 6 ) ；癌组织中C m e t 蛋白表达强度与血清H G F 浓度呈正相关( I P O 6 1 2 ) ；P L C 患者术前血清H G F 水平与肿瘤大小、有无合并肝硬硕士学位论文中文摘要化、有无门静脉癌栓存

4、在相关性，与术前肝功能、血清A F P 水平无相关性；癌组织中c m e t 蛋白表达强度与有无合并门静脉癌栓相关，与肿瘤大小、血清A F P 水平、有无合并肝硬化无相关性；术后有肿瘤复发或转移的病例，其术前血清H G F 水平及肿瘤组织中c m e t 蛋白表达显著高于无复发或转移的病例。结论：P L C 患者存在血清H G F 及癌组织中c m e t 蛋白的高表达；P L C 患者癌组织中c m e t 蛋白表达强度与血清H G F 浓度呈正相关；血清H G F 水平的升高和癌组织中c m e t 的过表达可能是P L C 术后早期复发或转移的一个重要因素。关键字肝细胞生长因子；c m e t ；原发性肝癌；免疫组织化学分析I I硕士学位论文英文摘要T h ee x p r e s so fH e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ra n di t sr e c e p t o rc - M e ti np r i m a r yh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m aA b s t r a

5、c tO b j e c t i v e ：T h i sr e s e a r c hf o c u so nt h ee x p r e s so fH e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ra n di t sr e c e p t o rc - M e ti np r i m a r yh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a M e t h o d s ：31p a t i e n t so fp r i m a r yh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m aw e r ec h o o s e dt ob ee x p e r i m e n tg r o u p ，a n dt h e r ew e r e31p a t i e n t so fe v e r yg r o u pw i t hD e c o m p e n s a t e dl i v e rc i r r h o s i s ，M i l dc h r o n i c

6、h e p a t i t i sBp a t i e n t sa n dn o r m a ll i v e rf u n c t i o ni np a t i e n t sw i t hg a l l b l a d d e rp o l y p sw e r ec h o o s e dt ob ec o n t r o lg r o u p s U s i n ge n z y m ei m m u n o a s s a y ( E L I S A )q u a n t i t a t i v em e t h o dt od e t e r m i n a t i o nt h ee x p e r i m e n t a lg r o u pt h a to n ed a yb e f o r eo p e r a t i o n ，a n da f t e rt h ef o u r t h t h en i n t h t h ee l e v e n t hd a y so fs e r u mH G Fc o n c e n t r a t i o n U

7、s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i c a la n a l y s i sa n dR e v e r s et r a n s c r i p t a s ep o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ( R T - P C R ) t od e t e c t i o no fc a r c i n o m a ，p a r a c a r c i n o m aa n dn o r m a ll i v e rt i s s u ei nc m e tp r o t e i ne x p r e s s i o n T h es a m em e t h o dt h ec o n c e n t r a t i o n so fs e r u mH G Fd e t e c t i o nc o n t r o lg r o u p A tt h es a m et i m ea n a l y s i so ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e

8、nt h ep r e o p e r a t i v eH G Fl e v e li ns e r u ma n dc a n c e rt i s s u ei nt h ee x p r e s s i o no fc - m e td e g r e ew i t hd i f f e r e n tc l i n i c o p a t h o l o g i c a lf a c t o r sa n di n f l u e n c et h ef a c t o rt h a tt h ec h a n g e so ft h es e r u ml e v e lo fH G Fa f t e ro p e r a t i o n R e s u l t ：P L Cp a t i e n t sw i t hd e c o m p e n s a t e dl i v e rc i r r h o s i sp a t i e n t sI I Iw i t hs e r u mH G Fc o n c e n t r a t i o ni sh i g h e

9、rt h a nt h en o r m a lc o n t r o lg r o u pa n dt h eg r o u po fc h r o n i ch e p a t i t i sB ，t h ed i f f e r e n c eh a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t ；P L Cp a t i e n t sw i t hd e c o m p e n s a t e dl i v e rc i r r h o s i sp a t i e n t sb e t w e e ns e r u mH G Fc o n c e n t r a t i o n so fn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ；P o s t o p e r a t i v eH G Fc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s ep e a ka p p e a r e do nt h ef o u r t hd a y , A f t

10、e rn i n t h ，e l e v e n t hd a y sd e c r e a s e dg r a d u a l l y F r o mt h ep r e o p e r a t i v et op o s t o p e r a t i v ed a yf o u r t h ，R e s e c t i o no fl a r g es e c t i o ni n c r e a s e dm o r eo b v i o u s l yt h a ns e g m e n tr e s e c t i o ni ns e r u mH G Fc o n c e n t r a t i o n s ( P = 0 0 21 ) ；E x p r e s s i o no fc - m e tp r o t e i ni nc a r c i n o m at i s s u ei n t e n s i t yw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fa d ja c e n tt i

11、 s s u e sa n dn o r m a lt i s s u e s ，B u ti na d j a c e n tc a r c i n o m at i s s u e ，T h ee x p r e s s i o no fc - m e tp r o t e i ni nl i v e rc i r r h o s i sg r o u ph i g h e rt h a ni nt h o s ew i t h o u tl i v e rc i r r h o s i sg r o u p ( P = 0 0 2 6 ) ；C m e tp r o t e i ne x p r e s s i o ni nc a n c e rt i s s u ea n ds e r u mH G Fc o n c e n t r a t i o nw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h ei n t e n s i t yo f( R 亍O 612 ) ；P L Cp a t i e n t sp r e

12、o p e r a t i v es e r u mH G Fl e v e l sw a sc o r r e l a t e dt ot u m o rs i z ea n dT h e r ei sn oc o m p l i c a t e dw i t hl i v e rc i r r h o s i sa n dT h e r ea r en or e l e v a n tt op o r t a lv e i nt u m o rt h r o m b i ；C o m p a r e dw i t ht h ep r e o p e r a t i v el i v e rf u n c t i o n ，s e r u mA F Pl e v e l sw i t h o u tc o r r e l a t i o n C a n c e ro fc - m e tp r o t e i ne x p r e s s i o ni ns t r e n g t hw i t ha n dw i t h o u tc o m b i n e dw i t hp o

13、 r t a lv e i nt u m o rt h r o m b u sa s s o c i a t e d ，A n dt h e r ei sn oc o r r e l a t i o nw i t ht h es i z eo ft h et u m o r , t h es e r u mA F Pl e v e l ，a n dt h e r ea r en oc i r r h o s i so ft h el i v e r ；T h ec a s eo fP o s t o p e r a t i v et u m o rr e c u r r e n c eo ri vm e t a s t a s i s ，p r e o p e r a t i v es e r u mH G Fl e v e la n dc M e tp r o t e i ne x p r e s s i o ni nt u m o rt i s s u e sw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a to fn or

14、 e c u r r e n c eo rm e t a s t a s i s C o n c l u s i o n ：T h ep r e s e n c eo fs e r u mH G Fi np a t i e n t sw i t hP L Ca n dt h ee x p r e s s i o no fc - m e tp r o t e i ni nc a n c e rt i s s u eh i g h l ye x p r e s s e di nt h ec a s e s ；P L Cc m e tp r o t e i ne x p r e s s i o ni np a t i e n t sw i t hc a r c i n o m at i s s u ea n ds e r u mH G Fc o n c e n t r a t i o nw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t hi n t e n s i t y ；E l e v a t e dl e v e l so fs e r

15、u mH G Fa n dc m e te x p r e s s i o ni nc a n c e rt i s s u et h a tp r o b a b l yi sa ni m p o r t a n tf a c t o ri nt h ee a r l yp o s t o p e r a t i v er e c u r r e n c eo rm e t a s t a s i s K e y w o r d s ：H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ( H G F ) ；C m e t ；P r i m a r yh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a ( P L C ) ；I m m u n o h i s t o c h e m i c a la s s a yV硕士学位论文目录目录中文摘要I英文摘要。I I I第一章绪论1第二章实验方法22 1 实验对象22 2 实验方法22 3 临床资料收集52 4 随访62 5 统计分析6第三章结果7第四章讨论1 2第五章

16、结论1 6参考文献1 7综j 苤2 0致谢一3 2V I硕士学位论文第一章绪论第一章绪论H G F 是肿瘤生长、侵袭和形成新生血管的影响因子，其最初从大鼠的血清中分离得到，是一种较强的刺激肝细胞增殖的分裂细胞原，在细胞间质中表达，主要由肝星形细胞( h e p a t i cs t e l l a t ec e l l ，H S C ) 产生。其受体c m e t 是原癌基因c m e t 编码的一种跨膜蛋白，由5 0 K D 的0 【亚基和1 4 5 K D 的D 亚基组成，是具有酪氨酸激酶活性的一种受体。H G F 与其受体c m e t 特异结合后，可激活c m e t 上的酪氨酸蛋白激酶，受体自身被酪氨酸磷酸化。同时进一步激活使得分裂的细胞原活化成M A P K 3 t ，M A P K 3 在其激活的靶蛋白上再进行酪氨酸磷酸化，这一布式磷酸化反应将外界信号逐级放大后，最终传到细胞核内部，导致了细胞的增殖与分化 2 1 ，从而刺激上皮细胞与肿瘤细胞的增殖、发展、迁移、转录和形态发生【3 】o2 1 世纪初，曹玉、王芳等4 1 研究发现，肝脏切除术后，残留肝脏出现再生现象，H G

17、 F c m e t 系统此时处于活跃状态，H G F 在肝脏增生过程中一直持续生长，直到肝脏达到或接近其原来体积为止，其认为这与P L C 术后复发、转移存在着密切关系，并提出了对P L C 的侵袭与转移起决定作用的是H G F 及其受体c m e t的观点。本研究主要通过分析P L C 患者血清H G F 与其癌组织中c m e t 蛋白的表达水平，及其表达与临床病理因素之间存在的联系，探讨H G F c - m e t 在P L C 发生发展中的作用。硕士学位论文第二章实验方法第二章实验方法2 1 实验对象实验组：原发性肝癌( P L C ) 患者组3 l 例。3 个对照组：1 、肝功能正常的胆囊息肉患者组3 1 例；2 、轻度慢性乙型肝炎组3 1 例；3 、肝硬化患者组3 1 例。实验组所有P L C 患者均经病理确诊；对照组均经肝功能检查、肝脏B 超、C T 检查明确。2 2 实验方法2 2 1 标本采集实验组分别于术前1 天、术后第4 、9 、l l 天空腹采取静脉血5 m l ，离心处理，分离出血清，将血清置于8 0 。C 的冰箱中保存。P L C 标本切下后，即取1 0

18、 0 - 一2 0 0 c m 大小的癌组织及距肿瘤2 c m 的癌旁组织、及其正常肝组织各一块，立即放置于液氮中速冻之后，再置于- 8 0 冰箱中保存。对照组分组采取空腹静脉血5 m l ，离心处理，分离出血清，将血清置于一8 0 。C的冰箱中保存。2 2 2 检测实验组测定术前1 天、术后第4 、9 、l l 天血清H G F 浓度，通过酶联免疫方法( E L I S A ) 进行定量测定；检测癌组织、癌旁组织及正常肝组织中c m e t 蛋白表达，采用免疫组织化学分析及逆转录聚合酶链反应( R T - P C R ) 。对照组同法分组检测各组血清H G F 浓度。A 、主要试剂吸附酶链免疫试剂( E L I S A ) ( 美国R & D 公司) ；S P 试剂盒( 北京中山金桥生物技术公司) ；免疫组织化学( I H C ) 技术试剂，免疫人体H G F 受体M e t 多克隆的抗体( 北京中山金桥生物技术公司) ：R T - P C R 试剂( J z 海生物工程技术服务公司) ；逆转录酶( M M L V ) 、脱氧核普酸( d N T P ) 、S u p e r s c

19、 r i p t 试剂( 美国I n v i t r o g e n公司) ；T E TD N A 聚合酶( 大宝生物工程有限公司) ；琼脂糖、澳化乙锭( a n 拿大2硕士学位论文第二章实验方法S a n g o n 公司) 。B 、主要仪器与设备P T - 2 0 0D N A 自动扩增仪；电子天平；A F l 0 0 制冰机；低温高速离心机；K a d o k a凝胶图像分析系统：紫外微量分光光度计；电泳系统；超低温冰箱；一2 0 。C 的冰箱；L e i c a 切片机；O l y m p u s 光学显微镜；倒置显微镜；酶标仪等。C 、检测方法1 、血清H G F 测定：通过酶联免疫定量测定方法( E L I S A ) 进行，按照试剂盒说明书操作。其具体操作事宜与步骤如下：( 1 ) 标准曲线建立：建立标准孔8 孔，其中每孔含倍比稀释的H G F 标准品，浓度分别为：3 0 0 0p g m l ，2 5 0 0p g m l ，1 5 0 0p g m l ，5 0 0p g m l 。选择以下条件作为空白对照组：2 5 0p g m l ；1 2 0 p g m l ；

20、6 0 5p g m l ；3 0 2p g m l 。( 2 ) 加样：1 0 乙聚丙乙烯酶的标品中，加入1 5 0 9 L 的样本作为稀释液。同时，再分别加H G F 标准品与待测样各5 0 9 L 。( 3 ) 反应板实验：将反应板进行充分的混匀。同时，在室温( 2 0 2 5 摄氏度条件下) 孵育2 小时，接着洗去没有结合的H G F 。( 4 ) 洗板实验：用洗涤液将其反应板充分洗涤5 次，在滤纸上进行拍干。( 5 ) 加显色液：用辣根过氧化氢酶标记，加H G F 的多克隆抗体2 0 0 I t L 。混匀后置室温孵育1 7 5 小时。( 6 ) 洗板注意：洗板5 次。( 7 ) 孔的主要事宜：每孔加底物2 0 0 1 x L ，室温避光，显色时间为3 0m i n 。( 8 ) 终止液的终止反应：每孔加6 0 9 L B i o r a d 比色剂，比色仪对比4 9 0 n m处的比色，这样测出吸光值( A ) 。( 9 ) 计算结果：计算其标准品及待测标本的平均值，以标准品的平均值为空白平均值，绘制出标准曲线。参照标准曲线计算其浓度。2 、病理学检查切取肝细胞组织，放入福

21、尔马林液中。固定后，常规H E 染色。二甲苯透明I 与1 1 级，每级1 0 m i n 。6 0 温箱浸蜡4 h ，L 形金属柜中进行包埋。将组织标签蜡边编号，待蜡块凉后，进行修整。再将石蜡切片，展片于6 0 。C 中烤箱烤片4小时。二甲苯I 、I I 级脱蜡，每级1 0 m i n 。乙醇下行脱水，每级2 小时。苏木精硕士学位论文第二章实验方法染色5 至1 0 m i n 之后水洗，2 盐酸与酒精分化，再进行水洗，自来水“蓝化”，伊红染色，各级乙醇上行脱水。最后，常规封片，在光镜下阅片。3 、免疫组织化学分析用美国R & D 公司S P 试剂盒检测步骤如下：石蜡切片常规脱蜡，处理梯度水化，即同位于H E 染色；3 双氧水，室温孵培育5 至1 0 分钟，消除其内源性“过氧化物酶”活性；蒸馏水再冲洗；P B S 浸泡5 分钟，微波中抗原修复；5 正常山羊血清( 即P B S 的稀释) 予以封闭，室温孵育1 0 分钟，倾去其血清，勿洗，滴入兔抗人体受体M e t 的多克隆抗( 1 ：1 0 0 稀释) ，3 7 孵育1 至2 小时；P B S 冲洗5 分钟，3 次；再滴加“生物素”标记二

22、抗；7 。C 孵育3 0 分钟；P B S 冲洗5 分钟，3 次；滴加“链霉菌”抗生素、“一过氧化物”酶溶液，3 7 孵育3 0 分钟；P B S 冲洗5 分钟，3 次；同时，利用D A B 显色剂显色检验；自来水充分冲洗、复染、封片；光镜下阅片，判定其标准。高倍镜下进行观察，找到细胞胞浆内出现棕色颗粒者判断为阳性。2 0 0 倍显微镜下，随机选择5 个区域，计算每个视野内阳性细胞百分比，取得其平均值。采用半定量法评估受体M e t 表达的结果，强阳性( + + + ) ：阳性细胞数占5 0 以上；中度阳性( + + ) ：阳性细胞占1 5 至5 0 ；弱阳性( + ) ：阳性细胞占1 0 至1 5 ；阴性：阳性细胞比 5 e mV S 5 0 岁者1 9 例， 5 0 岁者1 2 例；术前肝功能分级( C h i l d 分级) A 级者2 4 例，B 级者7 例；术前A F P 水平：_ _ 4 0 0 u g 1 者9 例；伴肝硬化者2 0 例，不伴肝硬化者1 1 例；肿瘤大d x _ 5 c m 者1 3 例；伴门静脉癌栓者9 例，不伴者2 2 例；随访时间为2 年，随访率(

23、1 0 0 ) ，中位随访时间1 5 月，8例术后发生复发或转移，其中5 例发生肝内复发，3 例远处骨转移，该3 例患者分别于术后6 个月、1 2 个月、1 3 个月死亡( 见表1 ) 。表1 血清H G F 及癌组织中c m e t 蛋白的表达与不同临床病理因素之间的关系C - m e tp r o t e i n7 七斗七七+ 斗P性别男女年龄 5 0 岁 5 0 岁肝功能( C h i l d 分级)AB术前A F P 值( u g L )5 2 02 0 4 0 02 4 0 0肝硬化有无肿瘤大小1 51 1 3 71 61 1 1 80 6 2 51 91 1 9 31 21 2 l l0 6 2 52 41 0 7 270 8 8 40 4 2 51 41 1 0 880 7 1 491 2 7 80 2 5 52 01 3 3 91 10 5 9 30 0 0 831_ 5 c m1 31 3 7 10 0 0 11门静脉癌栓有91 4 2 20 0 0 30无2 20 8 6 94复发或转移有81 4 5 10 0 0 40无2 30 8 8 341 240 7 2 5

24、0 4 1 2920 3 2 50 7 5 80 2 6 30 0 7 90 0 3 40 0 1 7P 0 0 5 代表无统计学意义762374746565655m6883B2M硕士学位论文第三章结果各组血清H G F 浓度：肝功能正常的胆囊息肉患者组为0 6 6 5 + 0 1 0 4 n g m l ( 正常范围为0 3 7 - - 0 9 0 n g m 1 ) ，轻度慢性乙型肝炎组为0 7 6 4 士0 3 8 0 n g m l ，肝硬化失代偿组为0 9 8 2 0 - 土：0 5 3 0 n g m l ，P L C 组为1 0 6 3 士0 3 8 7 n g m l 。P L C 组与肝硬化失代偿组之间血清H G F 浓度差异无统计学意义( P O 0 5 ) ，但两者均高于轻度慢性乙肝组及肝功能正常的胆囊息肉患者组，差异有统计学意义( P 0 0 5 )( 表2 ) 。表2 各组H G F 浓度的比较注：与P L C 组相比， P 0 0 5 ，与肝硬化失代偿组相比，木P O 0 5 ，与轻度慢性乙肝组相比，”P 0 0 5 ，与肝功能正常的胆囊息肉组相比，P 0

25、0 5P L C 患者中，血清H G F 浓度上升峰值出现在术后第4 天，为1 3 8 5 + 0 1 5 6 n g m l ，术后第9 、1 1 天逐渐下降( 分别为1 0 7 8 - 4 - 0 3 9 0 n g m l 、0 9 5 8 4 - 0 2 9 8 n g m 1 ) 。血清H G F 浓度术后与术前比较，仅术后第4 天与术前比较差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ( 见表3 ) 。表3P L C 患者术前、术后H G F 浓度比较注：与术前比较，母P 0 0 5 硕士学位论文第三章结果术前1 天与术后第4 天比较，大区段肝切除与小区段肝切除患者血清H G F浓度上升的百分比差异比有统计学意义( p = O 0 2 1 ) ( 见表4 ) 。表4 术后第4 天H G F 浓度上升比例的影响因素木上升百分比= 术后H G F 浓度术前H G F 浓度x10 0 ，P 0 0 5 代表无统计学意义9硕士学位论文第三章结果c m e t 蛋白表达：3 1 例正常组织标本表现为阴性或弱阳性，其中弱阳性2 例，阴性2 9 例；3 1 例癌旁组织标本中，1 5 例表现为阴

26、性与弱阳性，1 0 例表现为中等阳性，6 例表现为强阳性；3 1 例癌组织标本中，4 例表现为阴性与弱阳性，1 6例表现为中度阳性，1 1 例表现为强阳性。癌组织中c m e t 蛋白表达强度显著高于癌旁组织及正常组织，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ( 见表5 ) 。表5c m e t 在不同组织中的表达注：与正常组织相比，母P 0 0 5 ，与癌旁组织相比， P O 0 5癌组织中，C m e t 蛋白表达强度与术前血清H G F 浓度呈正相关( 见表6 ) ：表6 癌组织中c m e t 蛋白表达强度与术前血清H G F 浓度的相关性分析7 ) 。伴有结节性肝硬化者癌旁组织中c m e t 蛋白表达强度高于无肝硬化者( 见表表7 有无合并肝硬化者癌旁组织中c m e t 蛋白表达强度比较P 0 0 5 代表无统计学意义1 0硕士学位论文第三章结果影响术前血清H G F 水平的主要因素有：肿瘤大小、有无合并结节肝硬化、有无合并门静脉癌栓，而性别、年龄、术前肝功能及血清A F P 水平与术前血清H G F 水平无相关性；影响癌组织中c m e t 蛋白表达强度的因素有：有无门

27、静脉癌栓，而性别、年龄、有无合并结节肝硬化、肿瘤大小、术前肝功能及血清A F P水平与癌组织中c m e t 蛋白表达强度无相关性；术后肿瘤复发或转移病例的术前血清H G F 水平及其癌组织中M e t 蛋白表达强度高于无复发、无转移病例( P O 0 5 )( 见表1 ) 。硕士学位论文第四章讨论第四章讨论H G F c m e t 通路调节多种细胞功能，包括细胞增殖、运动、分化、血管形成等【5 】。多种恶性肿瘤的发生与H G F c m e t 通路失调有关。既往研究表明，H G Fc m e t 通路在P L C 中过度激活。本实验亦显示，P L C 患者血清中H G F 浓度及癌组织中c m e t 蛋白表达强度均显著高于肝功能正常的胆囊息肉患者组，差异均有统计学意义。H G F c m e t 通路过度激活后，主要在以下几个方面对P L C 的发生发展起作用【6 】：1 、促进肿瘤血管生成：肿瘤生长和转移依赖于血管的生成。P L C 是一种典型的多血管肿瘤，血管生成直接促成了它的恶性生物学行为，研究表明【7 P L C 的血管生成与肿瘤的转移有密切关系。H G F 有强大的促

28、血管生成作用，它可以通过自分泌或旁分泌途径，直接作用于内皮细胞或影响其他血管生长因子( 如血管内皮生长因子) ，间接促进肿瘤血管的生成而导致转移。2 、增强肿瘤细胞的运动：细胞运动能力的增强是肿瘤侵袭转移的重要影响因素之一。研究显示，H G F 与c m e t 相互作用可使R h o 、R a c 和C d c 4 2 的信号转导通路活化而诱导肌动蛋白弹力纤维聚合及黏着斑复合体的形成，肌动蛋白在细胞膜上聚集，形成伪足、片足，增强细胞的运动。3 、促进细胞外基质的降解：肿瘤细胞离开原发病灶后，须穿过原发肿瘤周围的细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x ，E C M ) 才能进入脉管系统。H G F c m e t 通路能诱导基质金属蛋白酶和u P A 的表达促使E C M降解，从而促进肿瘤转移。4 、影响肿瘤细胞间的黏附：H G F c M e t 通路通过影响黏附分子的表达调节肿瘤细胞间的黏附作用，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。K i m 等【8 】报道H G F 对肿瘤细胞E 钙黏蛋白的易位及表达其诱导、调节作用，进而导致肿瘤细胞发生侵袭

29、和转移。由于H G F 在其他疾病中均有不同程度升高，为了解P L C 与其他非肿瘤性疾病H G F 是否存在差异，选定肝硬化失代偿、慢性乙肝以及肝功能正常的胆囊息肉患者作为对照进行研究。本实验显示肝硬化失代偿期患者、P L C 患者血清H G F浓度明显高于肝功能正常的胆囊息肉患者组及慢性乙肝组，差异有统计学意义，且肝硬化是术前H G F 高水平相关的病理因素；癌旁组织中，合并肝硬化者c m e t蛋白表达亦高于无肝硬化者，差异有统计学意义，提示肝硬化的发生发展与H G F c m e t 高表达相关。许多实验研究表明，H G F c m e t 信号不仅能促进肝功能的1 2硕士学位论文第四章讨论恢复，而且也可以改善肝纤维化。肝纤维化是指肝内纤维组织异常增生，其机制为E C M 合成降解失调，E C M 过度沉积所致。多细胞因子参与肝纤维化的发生，其中转化生长因子p 1 ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - b e t a1 ，T G F - 9 1 ) 起关键作用。H G F 可通过以下几个环节来预防和缓解肝纤维化，促进

30、肝功能恢复【9 J ：1 、促进E C M 降解，抑制胶原纤维合成I n a g a k i l l 0 1 等用H G F 处理培养的H S C ，发现I 型胶原0 【链的基因C O L l A 2 转录被抑制，同时，在活体实验中，H G F 抑制了四氯化碳诱导纤维化的小鼠肝组织中C O L l A 2 启动子的激活。2 、抑制上皮间质转化上皮间质转化( e p i t h e l i a l t o m e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n ，E M T ) 是指在某些特殊的生理或病理情况下，如胚胎形成、发育、组织创伤的愈合，器官纤维化及肿瘤细胞的转移过程中，上皮细胞发生形态变化和极性散失而间质化特征。肝脏纤维化过程中，肝细胞和胆管上皮细胞均可发生上皮间质转化，转化为成纤维细胞 1 1 , 1 2 。X i a 等1 33 研究发现，H G F 干预可以阻断在胆管结扎诱导的肝纤维化模型中的胆管上皮的上皮间质转化过程，从而使得肝纤维化得到改善。3 、抑制T G F D 1 合成及其信号转导T G F 9 1 是细胞生长、分化、免疫调节、炎症及损

31、伤修复中发挥重要作用的蛋白多肽，也是参与肝纤维化关键的一个细胞因子，它在肝脏炎症时促进肝细胞凋亡，诱导H S C 活化及E C M 的合成，促进肝纤维化进展，而H G F 可以减少T G F 9 1 的合成。S a t o 等阻4 1 将重组人肝细胞生长因子( r e c o m b i n a n th u m a nh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r ，r h H G F ) 注入肝纤维化大鼠体内，发现T G F 9 1 及原胶原纤维的m R N A 水平下降，从而抑制肝纤维。4 、抑制H S C 活化和增殖肝脏组织发生炎症反应时，T G F 9 1 等细胞因子激活静止的H S C ，转化为肝纤维化发生的主要细胞成分成纤维细胞，并合成分泌E C M 。最近，S o n 等引发现特异性抑制磷脂酰肌醇3 激酶( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s e ，P 1 3 K ) 信号转导途径后，H S C 的增殖、活化被抑制，凋亡增加，胶原纤维及一些纤维化相关基因表达均显著减

32、少，E C M 沉积减少。这说明H G F 达到预防和缓解肝纤维化的作用，除了靠阻断T G F B 1 作用来抑制H S C 活化外， 1 6 , 1 7 3 ，还可能通过干扰H S C 内的P 1 3 K A k t 信号通路来实现。5 、保护肝细胞，促进肝细胞再生H G F c m e t 信号对保护肝细胞的具有重要作用，c m e t 基因缺陷鼠对肝损伤具有高度敏感【l 引。H G F 抑制肝细胞凋亡、坏硕士学位论文第四章讨论死的机制之一是上调抗凋亡蛋白B c l x L 表达，此外，还可能减少肝脏的中性粒细胞浸润、杀伤19 2 0 3 。对小于5 c m 的小肝癌，如肝功能代偿，应力争切除，左叶者可酌情作局部切除、肝段或亚肝段切除；右叶或肝门区部，有肝硬化者宜局部切除，无肝硬化者可酌情作局部切除或肝叶切除。本实验中，肝部分切除后血清H G F 浓度迅速上升，峰值出现在术后第四天，且大区段切除比小区段切除者的血清H G F 浓度的上升更明显，进一步提示H G F 能促进肝脏的再生和修复，且提示肝脏的切除范围影响着术后血清H G F 水平。J o a n n aD u 纽i e w

33、 s k a 、X UW e i 等【2 1 ，2 2 1 研究表明，部分肝脏切除诱导肝脏损伤，肝脏损伤诱导H G F 的产生，而H G F 是促进肝细胞D N A 合成的强大信号，对损伤肝脏的增生、修复起着重要作用。本实验结果显示，癌组织中c m e t 蛋白表达强度显著高于正常组织，且血清H G F 水平与其受体c m e t 表达做S p e a r m a n 检验，相关系数r = 0 6 1 2 ，存在正相关，说明在肝癌组织中c m e t 蛋白的表达随血清H G F 浓度的增加而增加。癌细胞的增殖与迁移是肿瘤发生浸润与转移的重要前提，H G F c m e t 在肝癌组织中呈现高表达可能是P L C 肿瘤细胞侵袭和迁移能力增加的重要因素之一。由于组织细胞c m e t 蛋白异常高表达，导致其对H G F 敏感性增强，从而促使该细胞过度增殖、分化乃至恶化，导致肝脏组织的恶变。国内黎洪浩【2 3 】等研究表明，H G F 及c m e t 在肝癌及癌栓中的表达量均显著高于正常肝组织及癌旁组织，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ，H G F 及c m e t 在癌栓中表达量

34、显著高于其在肝癌中表达量( P 0 0 5 ) ，认为肝癌患者H G F c m e t 表达量的升高可能是肝癌发生肝内转移形成癌栓的原因，即H G F c m e t 表达量的升高促进了肝癌的发展。因此其认为，H G F c m e t 的阳性表达可作为诊断肝癌的指标，而肝癌患者H G F c M e t 的动态检测可以了解肝癌的进展，即是否出现肝内转移形成癌栓。进一步研究H G F c m e t 在肝癌发生发展中的作用机制，将有可能为肝癌的预防和治疗提供一个新的靶基因。本实验亦表明，门静脉癌栓是与术前H G F 高水平及癌组织c m e t 蛋白高度表达相关的病理因素，支持上述观点。我们比较有、无术后肿瘤复发或转移组的血清H G F 和癌组织中c m e t 蛋白表达水平，结果显示术后有肿瘤复发或转移组的血清H G F 水平和癌组织中c m e t表达均显著高于无复发或转移组。这一结果提示血清H G F 水平的升高和癌组织1 4硕士学位论文第四章讨论c m e t 的过度表达可能是肝癌术后早期复发或转移的一个重要因素。蔡云峰等【2 4 J研究发现，术后复发时间越早的患者，其c m

35、 e t 的m R N A 转录及蛋白的表达水平越高，黄志强等【2 5 】研究表明，术后H G F 的增长倍数与肿瘤组织内c m e t 蛋白的过度表达在术后复发与未复发者中差别有显著性意义( P O 0 5 ) ，两年内复发者明显高于两年后复发及未复发者，均与本实验相符。研究表明，术后早期复发灶中，大多数复发肿瘤细胞内的D N A 含量与原发肿瘤内的含量相似，提示可能复发肿瘤与原发肿瘤是单克隆来源【2 酬，因此推测肝癌切除前可能已经发生转移，或者某种因素促进了肿瘤细胞的浸润转移与生长，才导致术后早期的复发转移。H G F 具有明显的促细胞分裂、细胞动力以及血管形成等多种作用，而这些条件是肿瘤细胞浸润转移所必需的。术后血清H G F 水平升高及肝癌组织中c m e t 蛋白过量表达为H G F 提供了大量受体，可能是导致肝癌术后早期复发转移的重要因素之一。硕士学位论文第五章结论第五章结论l 、P L C 患者存在血清H G F 及癌组织中c m e t 蛋白的高表达；2 、P L C 患者癌组织中c m e t 蛋白表达强度与血清H G F 浓度呈正相关；3 、血清H G F 水平的升

36、高和癌组织中c m e t 的过表达可能是P L C 术后早期复发或转移的一个重要因素。1 6硕士学位论文参考文献参考文献 1 】D e r k s e n ，P a t r i c kWB P W ；K e e h n e n ，R o b e r tMJ R M ；E v e r s ，L u d oM L M ，e ta 1 C e l ls u r f a c ep r o t e o g l y c a ns y n d e c a n 一1m e d i a t e sh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o rb i n d i n ga n dp r o m o t e sM e ts i g n a l i n gi nm u l t i p l em y e l o m a B l o o d ，2 0 0 2 ，9 9 ( 4 ) ：1 4 0 5 1 4 1 0 【2 康文菲，张尚忠，郝洪升等转化生长因子在原发性肝癌中的表达及其意义探讨中国肿瘤临床，2 0 0 0 ，2 7 ( 2 ) ：9 3 9 5 【3 】C i e

37、c i e r s k iR ，W i s n i e w s k iM ，P a c z e kL L i v e rr e g e n e r a t i o n P 0 1 M e r k u rL e k a r s k i ，2 0 0 5 ，1 8 ( 1 0 6 ) ：4 7 3 - 4 7 7 4 曹玉，王芳，韩锐肝细胞生长因子在肿瘤侵袭转移中的作用国外医学肿瘤学分册，2 0 0 3 ，3 0 ( 1 ) ：1 0 1 3 5 K a p o s i - N o v a kP ，L e eJ S ，G b m e z Q u i r o zL ，e ta 1 M e t r e g u l a t e de x p r e s s i o ns i g n a t u r ed e f i n e sas u b s e to fh u m a nh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a s 、析t hp o o rp r o g n o s i sa n da g g r e s s i v ep h e n o t y

38、 p e JC l i nI n v e s t ，2 0 0 6 ，1 1 6 ( 6 ) ：1 5 8 2 - 1 5 9 5 6 】6 薛秀成，房淑彬H G F c m e t 通路及其与肝癌和胆管癌的相关研究国际肿瘤学杂志，2 0 0 8 ，3 5 ( 1 0 ) ：7 8 0 7 8 3 【7 】P a n gR W , J o hJ W , J o h n s o nP J ，e ta 1 B i o l o g yo fh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a A n nS u r gO n c e l ，2 0 0 8 ，15 ( 4 ) ：9 6 2 9 71 8 】K i mC H ，K i mJ ，K a h n gH ，e ta I C h a n g eo fE c a d h e r i nb yh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ra n de f f e c t so nt h ep r o g n o s i so fh y p o p h a r y n g

39、c e lc a r c i n o m a A n n a l so fS u r g i c a lO n c o l o g y , 2 0 0 7 ，1 4 ( 5 ) ：1 5 6 5 - 1 5 7 4 【9 】黄莹莹，孙剑勇肝细胞生长因子与肝纤维化关系研究进展医学综述，2 0 1 l ，1 7 ( 6 ) ：8 2 5 8 2 7 1 0 I n a g a k iYH i g a s h iK ，K u s h i d aM ，e ta 1 H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o rs u p p r e s s e sp r o f i b r o g e n i cs i g n a lt r a n s d u c t i o nv i an u c l e a re x p o r to fS m a d 3 、i mg a l e c t i n - 7 G a s t r o e n t e r o l o g y , 2 0 0 8 ，1 3 4 ( 4 ) ：1 1 8 0 1 1 9 0 【1 1 Z e i s

40、 b e r gM ，Y a n gC Q ，M a r t i n oM ，e ta 1 F i b r o b l a s t sd e r i v ef r o mh e p a t o c y t e si nl i v e rf i b r o s i sv i ae p i t h e l i a lt om e s e n c h y m a lt r a n s i t i o n JB i o lC h e m ，2 0 0 7 ，2 8 2 ( 3 2 ) ：1 7硕士学位论文参考文献2 3 3 3 7 2 3 3 4 7 12 】D i a zR ，K i mJ W ，H u iJ J ，e ta 1 E v i d e n c ef o rt h ee p i t h e l i a lt om e s e n c h y m a lt r a n s i t i o ni nb i l i a r ya t r e s i af i b r o s i s H u mP a t h o l ，2 0 0 8 ，3 9 ( 1 ) ：1 0 2 - 1 1 5

41、13 X i a 儿，D a iC S ，M i c h a l o p o u l o sG K ，e ta 1 H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ra t t e n u a t e sl i v e rf i b r o s i si n d u c e db yb i l ed u c tl i g a t i o n A mJP a t h o l ，2 0 0 6 ，16 8 ( 5 ) ：15 0 0 1512 14 S a t oM ，K a k u b a r iM ，K a w a m u r aM ，e ta 1 T h ed e c r e a s ei nt o t a lc o l l a g e nf i b e r si nt h el i v e rb yh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ra f t e rf o r m a t i o no fc i r r h o s i si n d u c e db yt h i o a c e t a m i d e

42、 B i o c h e mP h a r m a c o l ，2 0 0 0 ，5 9 ( 6 ) ：6 81 - 6 9 0 15 】S o nqH i n e sI N ，L i n d q u i s tJ ，e ta 1 I n h i b i t i o no fp h o s p h a t i d y l i n - o s k o l3 - k i n a s es i g n a l i n gi nh e p a t i cs t e l l a t ec e l l sb l o c k st h ep r o g r e s s i o no fh e p a t i cf i b r o s i s H e p a t o l o g y , 2 0 0 9 ，5 0 ( 5 ) ：151 2 1 5 2 3 16 M e i n d l - B e i n k e rN M ，D o o l e yS T r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - b e t aa n dh e p a t o c y t

43、 et r a n s d i f f e r e n t i a t i o ni nl i v e rf i b r o g e n e s i s JG a s 仃o e nH e p a t - o l ，2 0 0 8 ，2 3 ( 1 ) ：$ 1 2 2 - S 1 2 7 【1 7 I n a g a l dY ，H i g a s h iK ，K u s h i d aM ，e ta 1 H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o rs u p p r e s s e sp r o f i b r o g e n i cs i g n a lt r a n s d u c t i o nv i an u c l e a re x p o r r to fS m a d 3w i t hg a l e c t i n 一7 J G a s t r o e n t e r o l o g y , 2 0 0 8 ，13 4 ( 4 ) ：1 l8 0 119 0 【18 I n a g a k iYH i g a s h iK ，K u

44、 s h i d aM ，e ta 1 H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o rs u p p r e s s e sp r o f i b r o g e n i cs i g n a lt r a n s d u c t i o nv i an u c l e a re x p o r to fS m a d 3w i t hg a l e c t i n - 7 G a s t r o e n t e r o l o g y , 2 0 0 8 ，13 4 ( 4 ) ：118 0 119 0 【19 N i s h i n oM ，I i m u r oYU e k iT ，e ta 1 H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ri m p r o v e ss u r v i v a la f t e rp a r t i a lh e p a t e c t o m yi nc i r r h o t i cr a t ss u p p r e s s i n ga p o p t o s i

45、 so fh e p a t o c y t e s S u r g e r y , 2 0 0 8 ，1 4 4 ( 3 ) ：3 7 4 3 8 4 2 0 】L iZ D ，M i z u n oS ，N a k a m u r aT A n t i n e c r o t i ca n da n t i a p o p t o t i ce f f e c t so fh e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ro nc h o l e s t a t i ch e p m i f i si nam o u s em o d e lo fb i l e - o b s t r u c t i v ed i s e a s e s A mJP h y s i o l G a s t r L ，2 0 0 7 ，2 9 2 ( 2 ) ：G 6 3 9 一G 6 4 6 21 】D l u z n i e w s k aJ ，Z o l i c hD ，P o l a n s k iJ ，e ta 1 H e p a t o c y t eg

46、r o w t hf a c t o rl e v e l si nl i v e ra n db l o o d ，a n dp o s t - o p e r a t i v el i v e rc e l lp r o l i f e r a t i o ni np a t i e n t s 谢t l lb e n i g na n dm a l i g n a n tl i v e rt u m o r sa f t e rp a r t i a lh e p a t e c t o m y M e dS c iM o n i t ，2 0 0 2 ，8 ：C R 6 9 0 - C R 6 9 6 1 R硕士学位论文参考文献 2 2 X uW ，W US G T h ep o s s i b l er e l a t i o n s h i pb e t w e e nh e p a t o m e g a l ya n dr e l e a s eo fH G Fi n t op l a s m ai n d u c e db yc l o f i b r a t ei

47、nr a t s W o r l dJG a s t r c e n t e r o l ，19 9 9 ，5 ：4 4 0 - 4 4 2 2 3 龙淼云，黎洪浩，郑启昌，等肝细胞癌门静脉癌栓中肝细胞生长因子及其受体的表达临床外科杂志，2 0 0 8 ，1 6 ( 3 ) ：1 6 1 1 6 3 2 4 】蔡云峰，甄作均，陈焕伟，苏树英肝癌术后肝再生状态与肝癌复发关系的初步研究中国普通外科杂志，2 0 0 8 ，1 7 ( 7 ) ：6 9 2 6 9 6 2 5 姜凯，黄志强，周宁新，等肝细胞生长因子及其c M e t 受体表达与原发性小肝癌术后复发关系的初步研究解放军医学杂志，2 0 0 3 ，2 8 ( 7 ) ：6 2 7 6 2 9 【2 6 丛文铭，吴孟超，陈汉等D N A 含量分析对复发性肝细胞癌克隆来源及其临床意义的初步研究临床肝胆病杂志，1 9 9 3 ，9 ( 1 ) ：3 5 1 9硕士学位论文综述综述细胞生长因子在P L C 中作用研究综述已l吉、，l口2 0 世纪人类对P L C 的研究取得了长足的进步。对病因的认识有所更新，乙型和丙型肝炎病毒、黄曲霉毒素

48、、饮水污染、饮酒以及遗传易感性等已成为P L C发病的主要背景；最流行的导致H C C 的因素是乙型肝炎病毒感染和丙型肝炎病毒感染。慢性乙型肝炎病毒感染流行于亚洲各国，并导致大多数的H C C t l l 。无症状P L C 的早期发现已成为现实，并证实普查可降低高危人群的P L C 死亡率；由于甲胎蛋白的应用和影像医学的进步，P L C 诊断己由“较难”变为“较易”；有效的治疗也由单一的外科变为以外科为主、局部治疗为辅、多种治疗方法和模式有机结合的格局；预后由“不治”变为“部分可治”；基础研究则由整体和细胞水平进入到分子水平。本文主要探讨P L C 现状与发展的研究，本文主要讲P L C 因子的概述，进一步我国P L C 的研究的发现，分析肿瘤坏死因子与P L C 的关系研究。应用实验方法分析，单核苷酸多态性芯片分析胰腺癌基因组杂合性缺失。并且本文写出关于P L C 的预防研究及解决P L C 复发转移研究展望分析。1 细胞生长因子简介细胞生长因子是一类具有刺激细胞生长活性的细胞因子。众所周知，人体的生长发育依赖的是生长素，但人脑垂体分泌的生长素通过科学证明只能在体内存在2 分钟左右

49、，在经过血液到达肝脏后，即迅速转化为生长因子。所以，在血液中只能检测到生长因子，而检测不到生长素。而人体的生长因子随着年龄的增长逐渐减少，表现出各种衰老症状。人体内不同的细胞产生的各种各样的生长因子能够促进细胞的生长、修复并补充营养。当人体组织由于疾病、创伤或衰老等原因而遭受损害时，脑垂体分泌生长素刺激生长因子产生，这些生长因子即像消防队一样赶去“救火”。杜帮博士将这一过程形象的比喻为“人类生长素是将军，生长因子就是基层的士兵，在组织内本土进行战斗”。生长因子对人体神经系统、2 0硕士学位论文综述免疫系统、内分泌系统、骨骼系统。消化系统。血液系统等均有重要作用。细胞生长因子目前分为E G F 表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、T 细胞生长因子等。1 1 细胞因子描述所谓细胞因子，就是一种在免疫系统中，存在着可溶性小分子蛋白质，并且这些蛋白质是细胞主动分泌出来的免疫性小分子多肽。这些蛋白质包含：干扰素，白介素，淋巴、肿瘤坏死、趋势化、集落刺激因子等。这些是关于系统免疫的细胞之间，免疫细胞系统与其他细胞发生核心联络，这样是能够分泌改变细胞本身以及其他行为的细胞或者性质，这些与细胞之间特

50、异发生膜受体而产生的作用。表1 细胞因子分类概述不同性质分类分类内容细胞种类淋巴因子、单核因子、非淋巴细胞、非单核巨噬细胞产生细胞因子白细胞介素、吉罗刺激因子、干扰素、肿瘤坏死因子、转化生长因子主要的功能- 1 3 家族、趋化因子家族、其它细胞因子这些里面我们见到有单核细胞、淋巴细胞、基质细胞等细胞组织，这些都是免疫的细胞体。1 2 细胞因子与P L C 之间的机理关系研究表明，细胞因子由免疫细胞分泌并参与机体免疫应答、细胞分化、调控造血、肿瘤免疫等多种生理和病理过程；以细胞因子为中心的调节机制和细胞应答出现异常可能是肿瘤细胞增殖的重要原因之一【2 J 。细胞因子为维持机体生理平衡，抵抗肝细胞病原的微生物侵袭，防止P L C 发生，机体之很多细胞，比如免疫细胞就是合成以及分泌多种微量肝细胞多肽类因子的。其与细胞间传递之信息，以及调节细胞生理过程，提高肝机体细胞免疫力。在异常的情况下，也常常有可引起现象“发烧，炎症，休克”等相关病理的过程。这一大类的因子，已经2 1硕士学位论文综述发现有着上百种的可能，统称是“细胞因子”，包含淋巴细胞而产生淋巴因子，单核细胞而产生单核因子，各种相关“生长

51、因子”等。关于大多数细胞因子，就是根据细胞因子的功能命名来的，例如，白细胞介素( I L ) ，集落刺激因子( C S F ) ，干扰素( I F N ) ，红细胞生成素( E P O ) 肿瘤坏死因子( T N F ) 等。1 3 信号传导通路与P L C 关系概述P L C 发生理论依据：肝炎病毒( i - m y 、H C V ) 与感染有关，它的特点是慢性，它的恶化是与P L C 周期、组织中的核酸的新陈代谢有关。P L C 发生的主要阶段如图1 ：图1P L C 细胞发展过程图本表说明P L C 的发生过程中的分子机制复杂多变，有关P L C 的研究资料显示，P L C 早期细胞大概4 0 0 0 个基因并且表达上调，有1 3 的基因是上调幅度大于2 倍，大概有1 1 0 的有上调8 倍之多，晚期的时候比较早期上调的多2 5 0 0 个基因【注释1 】。肝细胞在恶性循环中，主要是表现在图2 所示：图2 肝细胞体内循环简易图如图所示，P L C 在进展过程中，肯定是要肝细胞恶化的。作为胞外信号( 配体) 的生长因子与细胞表面或胞内受体等特异结合将信号传递到胞内，再以不同的复杂反

52、应完成理化功能。信号通路中上游信号主要是通过添加或者去除磷酸基团，改变了下游蛋白立体构象，从而对下游蛋白的活性进行激活或抑制调节3 1 ，“蛋白激酶和磷酸酶”就是通过此种方式作用于下游蛋白。而肝细胞外部受体接受硕士学位论文综述信号后，把信号传递到胞内，这一过程外部信号得到逐渐加强放大。如调节下游基因表达、基因转录和D N A 合成、细胞骨架构型、胞内酶活性等，经多种信号组合产生反应，科学研究已证实有多种信号通路与肝细胞的恶性转化相关。2 转化生长因子在P L C 细胞中的表达转化生长因子( T G F ) 是指能使正常表型细胞变成转化态的两个超家族细胞因子，包括T G F ( I t 和T G F B 。T G F u 属表皮生长因子相关肽家族成员；转化生长因子仅是由巨噬细胞，脑细胞和表皮细胞产生，可诱导上皮发育1 4 】。T G F p 属T G F p超家族成员，是一多功能蛋白质，可以结合到细胞表面的转化生长因子B 受体结合而激活其受体，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。人类转化生长因子一p 有三个亚型，T G F p1 ，T G F p 2 ，T G F 1

53、 3 3 。转化生长因子- p 受体是丝氨酸苏氨酸激酶受体。其信号传递可以通过S M A D 信号通路和或D A X X信号通路。T G F Q 是一种参与调节正常细胞和肿瘤细胞增殖和分化的细胞因子用异种的T G F c c 基因建立的转基因鼠可导致H C C 的发生，C h u a n g 等在H C C 患者的尿液中也发现了T G F 0 【，E G F R 的存在，这都表明T G F 0 【与H C C 有重要关系英国曾有报道仅2 8 的H C C 组织中有T G F 0 【的表达，而我们报道T G F 0 【在H C C组织中的阳性率高达7 4 3 ，这可能与中国的乙型肝炎发病率较高有关，因为转染乙型肝炎病毒( H B V ) 的人类肝细胞P L C 系可增加T G F 仪的表达另外，还发现T G F O 【与H C C 的分化程度关系密切：高分化的H C C 的T G F u 的阳性率明显高于低分化的H C C 据此推测：高浓度的T G F I , 可能是H C C 发生早期的致癌因素之一，而在晚期可能存在其他的致癌因素抑制了T G F a 的基因表达【5 J E G F R

54、 存在于人体的各种组织中，它可与某些转化蛋白( 癌基因产物) 具有在酪氨酸残基上磷酸化蛋白的能力，而酪氨酸蛋白激酶可能是调节细胞生长的重要环节e G F 。R 还能与c e r b B 2 、P 5 3 等癌基因协同作用，因此一些学者认为它与某些肿瘤的发生有关根据T G F 伍，E G F R 在H C C 及癌旁组织中的表达均明显升高，并且在E G F R阳性的组织中T G F 1 3 , 几乎同为阳性，二者呈显著正相关的结果所以认为，在H C C 的发生中可能存在着T G F 0 【的自泌循环，细胞产生内源性的多肽生长因子硕士学位论文综述- T G F a 作用于自身的功能受体E G F 。R ，从而表达其功能，致使细胞向恶性转化，而发生转化的细胞又可分泌T G F a ，因而引起了T G F 。a 和E G F R 的高表达，使肿瘤细胞形成不可抑制的生长此现象己在结肠癌细胞系中得到证实，同时这也说明T G F c 是通过与E G F R 的结合而完成使正常细胞向肿瘤细胞的转化这一过程此外，T G F 仅在肝内胆管( 其中一部分为增生的胆管) 上皮细胞中为阳性，结合以往有人发现在胚

55、胎发育和成人肝脏发育时，肝内胆管有T G F 。仅表达的报道，我们认为T G F O 【可能在肝内胆管形态发生和再生中起有重要的作用近年来各种细胞因子在癌瘤形成中的作用越来越多地受到关注。T G F D 1在肿瘤细胞的生长分化上起重要作用，与多种肿瘤形成有密切关系。一些研究已发现它在原发性P L C 组织中的表达明显增加。但目前许多体内外研究均证实T G F- - 1 3 1 对肝细胞生长具有强烈的抑制作用，而在P L C 中T G F p l 的高表达却与癌细胞生长率显著增高之间的矛盾提示T G F - 9 1 已失去了对癌细胞的生长抑制调控。分析其原因，可能是由于T G F p 1 的生物作用广泛，它的某些与癌细胞生长无关的特性影响到了肝细胞癌的发生发展。如T G F p 1 既能促进细胞外基质的形成和抑制其降解，又能增加某些蛋白酶的活性，增加基质蛋白的降解，提高活动性，降低粘着性，这些作用能提高肿瘤的浸润性，增加肿瘤的转移能力；另外T G F D l 是细胞免疫和体液免疫的强大抑制剂，也是血管生成的促进剂，可帮助癌细胞逃逸机体的免疫监视，为肿瘤形成提供丰富的血液供应，也增加转移的

56、危险性【6 】。有研究比较了转移高危组患者和转移低危组患者癌组织中T G F p 1表达，发现前者明显高于后者，提示T G F D 1 与转移危险度相关，这可能正是前述T G F p 1 对不同组织综合作用的结果。3 血管内皮生长因子与P L C 的联系血管形成是P L C 发生发展、侵袭和转移的基础，血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ，V E G F ) 可特异性促进血管内皮细胞分裂增殖并提高血管通透性。V E G F 是目前发现的刺激肿瘤血管形成的众多血管生成因子中最重要的促进因子。目前研究发现，V E G F 除了以旁分泌方式调节肿瘤的血管形成，即癌细胞分泌的V E G F 选择性作用于肿瘤血管内皮细胞上的特异性V E G F 受体( F i t 1和K D R ) ，并通过酪氨酸激酶介导的信号转导，调控内皮细胞分化和血管形成：2 4硕士学位论文综述另外越来越多的研究发现肿瘤中很可能存在V E G F 的自分泌机制，即多种癌细胞自身也有V E G F 受体的表达，而且针对V E

57、 G F 及其受体的干预措施可以改变这些肿瘤细胞的体外增殖活性和其他生物学特性。细胞因子必须通过与其特异性受体结合才能发挥生物学作用，V E G F 的自分泌途径也不例外。在对人类卵巢癌、血管瘤、黑色素瘤、乳腺癌、艾滋病卡氏肉瘤、前列腺癌、膀胱肿瘤以及神经胶质瘤的研究中相继发现：不仅在肿瘤血管内皮细胞中有V E G F 受体的表达，肿瘤细胞中也有F l t 1 和K D R 的表达( 其中多数肿瘤细胞以表达K D R 为主，这是肿瘤中V E G F 自分泌机制存在物质基础) 。有研究发现，肝癌细胞系S M M C 7 7 2 1 中有F l t 1 的表达，而H H C C 和H e p G 2 细胞有K D R 的表达【7 J ，这就提示可能在P L C 细胞中存在V E G F 的自分泌机制。F l t 1 和K D R 介导V E G F 的生理功能在V E G F 的旁分泌机制中并不相同。F l t 1则与维持内皮细胞之间、内皮细胞与基质之间的粘附有关，K D R 与内皮细胞的分化、增殖有关。而在V E G F 的自分泌机制中，两者却有着相似的功能。研究发现，外源性V E G

58、F 可以刺激有V E G F 受体表达的肿瘤细胞在体外增殖，而通过抑制肿瘤细胞V E G F 的表达可以抑制其体外增殖，V E G F 的这一自分泌调节功能是通过K D R 介导的。有研究表明，V E G F 本身可以上调K D R 的表达，且其表达调控是通过K D R 受体信号转导系统完成的。根据以上两点，可以推测肿瘤细胞中的V E G F 及其受体间存在一个正反馈环路，即肿瘤细胞分泌的V E G F 与肿瘤细胞V E G F 受体( 主要是K D R ) 结合后，其结果一方面是调节肿瘤细胞的增殖、分化，以促进V E G F 进一步表达；另一方面又诱导了V E G F 受体的高表达。而在这一正反馈环路的另一重要作用则是V E G F 调节肿瘤血管形成这一旁分泌作用的相应增强。在对成人T 淋巴细胞白血病研究中，V E G F 可能通过F i t 1 介导的自分泌途径使肿瘤细胞的趋化性上调，进而侵犯其他脏器。有研究显示通过体外抑制P L C 细胞V E G F 的表达，可以对表达K D R 的H H C C 细胞体外增殖有明显的抑制作用，并且随着反义O D N 浓度的增大，抑制作用也逐渐

59、增强；而对于表达F l t - 1 的S M M C 一7 7 2 1 细胞反义O D N 却没有明显作用。而反义O D N 对于H H C C 细胞膜表面K D R 表达的抑制作用，说明H H C C 细胞分泌的V E G F 能上调其受体K D R 的表达，反义O D N 通过抑制V E G F 的表达进而抑制了V E G F 对K D R表达的诱导作用；同时，反义O D N 对S M M C 7 7 2 1 细胞F i t 1 的膜表达无明显抑硕士学位论文综述制作用。据此可以得出这样的结论：H H C C 细胞中V E G F 与K D R 间可能存在一个正反馈环路，P L C 细胞表达的V E G F 可通过白分泌途径促进自身的分裂增殖，并且这一自分泌机制是通过K D R 介导的。4 胰岛素样生长因子与P L C 的联系胰岛素样生长因子( I G F ) 发生改变在肝细胞癌变过程中是必不可少的，胰岛素样生长因子I G F 家族在肝癌中异常表达并具有调节作用。I G F 。I I 是调节人胚胎生长发育的所必需的生长因子，它通过增强蛋白质和D N A 合成，促进了“细胞有丝分裂”，

60、此外通过激活糖原合成酶活性调节糖元代谢。I G F I I 主要在肝脏合成与分泌，活化胚胎型I G F I I 基因、激活启动子P 3 产生逆转胚胎表型达到的表达状态，激活I G F I 受体( I G F I R ) 上酪氨酸激酶途径合成与活化。在癌变过程中，I G F I I 呈动态进行性增加。癌细胞分裂过程中，由于肝脏供血的不足缺氧的状态，促使I G F I I 合成的增加，刺激癌组织中的新生血管形成j 。肝脏的发育主要通过“甲基化程度、I G F I I 基因以启动子、印迹状态”等进行调节。在供血不足缺氧状态下，P L C 细胞I G F I I 与V E G F 的m R N A 表达异常，可能是诱导I G F I I 表达的重要因素。在癌变中，重新表达胚胎型I G F I I m R N A ，上调表达I G F I I 。癌前结节与癌旁肝细胞出现“”提示存在癌变倾向，而表达水平愈高的预示着细胞癌变可能性越大，所以作为癌前“病变信号”，定期监测I G F I I表达是有利于病情观察和治疗及预后的判断。目前资料显示，肝组织I G F I I 有4个“启动子”( P 1 4 )

61、 ，6 种“结合蛋白”( I G F B P l 6 ) 阴，P 3 启动子持续活化导致I G F - I I表达，P 3 和P 4 启动子的再激活及P 1 启动子失活高度相关。在此过程中I G F s 参与了肝细胞分裂、分化、表达等一系列活动，但癌变是比较复杂的机制，I G F 的具体作用机制仍有待进行进一步研究。5 肝细胞生长因子与P L C 的关系肝细胞生长因子( h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r , H G F ) 表达于多种肿瘤细胞，是目前研究中促进肝细胞增殖最强的细胞因子，H G F 及其受体M e t ，形成了H G F M e t信号转导系统1 0 1 。目前已知，H G F 是一种多功能的细胞因子，它由间质细胞产生，并通过旁分泌方式与邻近细胞表面的受体M e t 结合并激活该受体的酪氨酸激酶2 6硕士学位论文综述条件下可转化为癌基因( O n c o g e n e ) 。癌基因的过度活化可使正常细胞转化为恶变的肿瘤细胞。研究表明：多种癌基因的编码产物是生长因子和生长因子信号传递途径中的蛋白质，这些基因的结构和表达的异

62、常使正常的细胞发生恶变。生长因子的结构异常可使细胞发生恶变。正常的酸性成纤维细胞生长因子( a F G F ) 无信号肽序列，具有信号肽的a F G F 可转化培养的细胞。转染含信号肽序列a F G F c D N A 的传代细胞可在裸鼠形成肿瘤。生长因子受体的结构异常可使细胞发生恶变。F m s 癌基因编码集落刺激因子1 ( C S F 1 ) 的突变型受体( f m s 蛋白) 。和正常的集落刺激因子1 受体( C S F 1 R )相比，f m s 蛋白缺失C S F 1 R 羧基端的4 0 个氨基酸，又在羧基端加上了1 1 个其它的氨基酸。f m s 蛋白在无C S F 1 作用的情况下持续激活，使细胞进入不受控的增生状态。E r b B 癌基因编码N 端缺失的表皮细胞生长因子受体( E G F R ) E r b B 蛋白。E r b B 蛋白的N 末端缺失，不能结合E G F ，保留着酪氨酸激酶的活性。E r b B蛋白在无E G F 1 的情况下自发形成二聚体，处于持续性激活状态。由f m s 蛋白和E r b B 蛋白表现的配体非依赖性受体激活是一种细胞恶变的机制。胞内

63、信号传递蛋白结构异常可使细胞发生恶变。R a s 是一种鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，结合在细胞膜的内面，中介多种生长因子受体激活后的细胞信号传递。结合G T P 的R a s 蛋白是活性形式，结合G D P 的R a s 蛋白是非活性形式。R a s蛋白是一种G T P 酶，它催化R a s 结合G T P 水解成G D P ，进而使R a s 由激活形式转化为非激活形式。R a s 癌基因编码有点突变的R a s 蛋白，此蛋白的G T P 酶活性受抑，在结合G D P 的情况下也处于活性状态。突变的R a s 蛋白在无受体激活的状态下持续地向它的信号传递靶蛋白传递信号。这种受体非依赖性信号传递分子的激活也是细胞恶变的一种机制。核转录因子结构异常可使细胞发生恶变。M y c 基因编码的M y c 蛋白是一种D N A 结合蛋白，介导多种生长因子的信号传递。M y c 蛋白的异常过度表达可使细胞发生癌变。有许多事实可以证明这一点。逆转录病毒在感染细胞后，其长末端重复序列( L T R ) 可整合入M y c 的基因组并控制M y c 基因的转录，使M y c的表达水平明显升高，导致白血病的发生

64、。当人的M y c 基因自第8 号染色体转位到第1 4 号染色体后，M y c 基因转录可在免疫球蛋白( I g ) 调控基因的控制下进行，处于高表达状态，在这种情况下会发生淋巴瘤。L T R M y c 基因转基因小鼠可发2 8硕士学位论文综述生多种类型的恶性肿瘤。I g 重链增强子M y e 基因转基因小鼠多发生淋巴瘤。7 展望及总结生长因子一直以来是生命科学领域研究的热点，生长因子对P L C 的影响和作用机制的研究已经有很多年了，也取得了一些成果，但总的来说还远远不够，体内各种生长因子都是相互联系，共同作用与某些生理过程，故研究时应综合几种因子一起考虑，这也带来了不少的难度，故要求研究者要熟练掌握相关专业知识。生长因子研究方面的科研力量相对孤立和分散，在研究与发展的道路上有很多的科学问题需要科学家团结协作解决，重点进行生长因子基础研究、临床研究和应用研究，并推动生长因子新药的产业化进程。2 9硕士学位论文综述参考文献【1 T h o m a sY a u ，P i e r r eC h a n ，R i c h a r dE p s t e i n ，R o n n i eTP

65、 o o n E v o l u t i o no fs y s t e m i ct h e r a p yo fa d v a n c e dh e p a t o c e l l u l a rc a r c i n o m a J W o r l dJ o u m a lo fG a s t r o e n t e r o l o g y , 2 0 0 8 ，( 4 2 ) ：6 4 3 7 - 6 4 41 【2 】李骞，马传香渤玉英等；原发性肝癌患者C D l 0 5 ，V E G F 及T G F 1 3 表达及临床意义山东医药2 0 1 1 ，5 1 ( 4 7 ) ：1 0 5 1 0 6 【3 L i uG ；M e n gX ，J i nY , B a iJ , Z h a oY , C u iX ，C h e nF ，F uS I n h i b i t o r yr o l eo ff o c a la d h e s i o nk i n a s eo na n o i k i si nt h el u n gc a n c e rc e l lA 5 4

66、 9 C e l lB i o lI n t ，2 0 0 8 ，3 2 ：6 6 3 6 7 0 【4 】康文菲，郝洪升等，转化生长因子在原发性P L C 中表达及其意义探讨，中国肿瘤临床2 0 0 0 2 7 ( 2 ) 9 3 9 5 5 张静，李青，乔庆等，仅转化生长因子及其受体在人原发性肝细胞P L C 中表达意义，世界华人消化杂志，1 9 9 9 ，7 ( 11 ) 9 3 9 9 4 2 【6 V a c h o nP H ，H a r n o i sC ，G r e n i e rA ，D u f o u rG , B o u c h a r dV , H a nJ , L a n d r yJ , B e a u l i e uJ F , V 6 z i n aA ，D y d e n s b o r gA B ，G a u t h i e rR ，Ct 6 A ，D r o l e tJ F , L a r e a uED i f f e r e n t i a t i o ns t a t e s e l e c t i v er o l e so fp 38 i

67、 s o f o r m si nh u m a ni n t e s t i n a le p i t h e l i a lc e l la n o i k i s G a s t r o e n t e r o l o g y , 2 0 0 2 ，12 3 ：19 8 0 - I9 91 7 t 宏光，陈训如，李开宗等，肝癌细胞中血管内皮生长因子的自分泌及其意义，中国癌症杂志，2 0 0 4 ，1 4 ( 2 ) 1 5 7 1 6 0 8 R i c h a r d s o nN E ，D a v i e sD J ，M e a k i nB J ，N o r t o nD A T h ei n t e r a c t i o no fp r e s e r v a t i v e s谢mp o l y h y d r o x y e t h y l m e t h a c r y l a t e ( p o l y H E M A ) JP h a r mP h a r m a c o l ，19 7 8 ，3 0 ：4 6 9 4 7 5 9 D eH e r d tM

68、J ，B a a t e n b u r gd eJ o n gR J H G Fa n dM e ta Sp o t e n t i a lo r c h e s t r a t o r so fi n v a s i v eg r o w t hi nh e a da n dn e c ks q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a F r o n tB i o s c i ，2 0 0 8 ，( 1 3 ) ：2 51 6 - 2 5 2 6 I O ：E 庆军，孙抒，李宏丹，魏嘉，苏荣健肝细胞生长因子对肝细胞癌侵袭和转移的影响【J 】世界华人消化杂志，2 0 0 8 ，1 6 ( 2 8 ) ：3 1 5 2 3 1 5 6 3 0硕士学位论文综述 11 Z e n gQH ，M c c a u l e yLK ，W a n gCYH e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ri n h i b i t sa n o i k i sb yi n d u c t i o no fa c t i v a t o

69、rp r o t e i n1 - d e p e n d e n tc y c l o o x y g e n a s e 一2 JB i o lC h e m ，2 0 0 2 ，2 7 7 ( 5 1 ) ：5 0 1 3 7 5 0 1 4 2【1 2 蔡觅，周钢桥等，胰岛素样生长因子系统与P L C ，中国生物化学与分子生物学报，2 0 11 ( 5 ) ：3 9 1 - 3 9 6 1 3 】苏荣健，李贞，李宏丹，宋慧娟，程留芳肝细胞生长因子对肝细胞癌细胞系S M M C 7 7 2 1黏着斑激酶的影响 J 世界华人消化杂志，2 0 0 9 17 ( 2 0 ) 2 0 7 0 2 0 7 3 3 1硕士学位论文致谢致谢研究生的学习生活即将结束，在学习及做人做事方面都收获了许多，在此向所有帮助爱护我的老师、同学、朋友和家人表示最真诚的谢意。首先感谢我的导师王群伟教授对我的精心培养和关心爱护。王老师用渊博的知识、严谨的治学态度、勇于开拓创新的精神，以及宽以待人、严于律己的坦荡胸怀对我们言传身教，令我受益终身，是我终生学习的榜样。衷心感谢普外科全体老师在我学习过程中给予的支持和帮助，令我受益匪浅。衷心感谢我的师兄弟潘凯华、段文斌、陈晨、杨鹏生在学习生活上的帮助，师兄弟友谊天长地久。最后衷心感谢我的家人对我一贯的支持和理解，使我能全身心投入到学习工作当中，他们的无尽支持是我一生最大的财富!感谢各位审稿和答辩委员会的专家对本文的修正和指导! 谢谢13 2

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